Beginne damit, eine geopferte schwangere Maus auf den Rücken auf ein Sezierbrett zu legen. Kneifen Sie mit einer Pinzette die Bauchmittellinie zusammen. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere den Bauch durch die Haut und das Bauchfell von den Genitalien bis zum Brustkorb über die Mittellinie.
Entfernen Sie die Gebärmutter mit den Embryonen und legen Sie sie sofort auf Eis. Schneiden Sie vorsichtig den Dottersack an den Plazentaseiten durch und entfernen Sie die Embryonen. Legen Sie dann die enthaupteten embryonalen Köpfe in eine Eisschale, die kalzium- und magnesiumarmes HBSS enthält.
Legen Sie den Kopf nach links in eine 35-Millimeter-Schale. Durchstechen Sie ein Auge mit dem Rand der Pinzette und halten Sie mit dem anderen das Kinn fest. Reißen Sie die Kopfhaut sanft vom Nacken entlang der Mittellinie in Richtung Schnauze ab.
Verwenden Sie die abgewinkelte Pinzette, um durch das weiße ovale Rückenmark einzudringen und den Schädel entlang der Mittellinie aufzubrechen, wodurch das Gehirn freigelegt wird. Ziehe den Schädel vorsichtig von den Seiten ab. Heben Sie dann das Gehirn aus dem Schädel und entsorgen Sie den Schädel.
Verwenden Sie eine Pinzette, um die Hirnhäute zu entfernen. Legen Sie die Gehirne in ein Bijou, das zwei Milliliter HBSS mit Kalzium- und Magnesiummangel enthält. Fügen Sie dem Bijou 250 Mikroliter 10X-Trypsin hinzu.
Reiben Sie das Gehirn durch Schütteln des Bijous und inkubieren Sie es dann 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie jedem Bijou zwei Milliliter Sojabohnen-Trypsin-Hemmer hinzu. Schütteln, um den Hemmstoff gleichmäßig zu verteilen.
Übertragen Sie ohne Zentrifugieren zwei Milliliter des Überstands von jedem Bijou in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Saugen Sie die Suspension mit einer 19-Gauge-Nadel, die an einer Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist, zweimal ab, um die verbleibenden Zellen im Bijou zu verreiben. Wiederholen Sie die Aspiration zweimal mit einer 21-Gauge-Nadel.
Mit einer 23-G-Nadel die Zellen aus dem Bijou in das 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit dem Zellüberstand überführen und bei 200 G fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Mit einer serologischen Fünf-Millimeter-Pipette wird der gesamte Überstand in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt, ohne das Pellet zu stören. Wiederholen Sie die Zentrifugation.
Geben Sie 10 Milliliter des Beschichtungsmediums in ein Röhrchen mit den kombinierten Pellets aus beiden Zentrifugationsschritten und mischen Sie es gut, bis eine ganze Suspension entsteht. Färben Sie die Zellen mit Trypanblau und zählen Sie sie mit einem Hämozytometer oder einem Zellzähler. Platten Sie die Zellen, indem Sie das erforderliche Volumen der embryonalen E17-Hirnzellsuspension der Maus in eine Well-Platte geben.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius unter 5 bis 7 % Kohlendioxid für zwei bis vier Stunden. Nachdem Sie das Medium entfernt haben, fügen Sie jedem Well ein neues Differenzierungsmedium hinzu. Drücken Sie alle schwimmenden Deckgläser mit einer sterilen Pipettenspitze nach unten.
Pflegen Sie Kulturen, indem Sie dreimal pro Woche einen Teil des Überstandes entfernen und durch frische Differenzierungsmedien ersetzen. Die Kulturen wurden durch Immunfluoreszenzfärbung für NG2 und Nestin als Entwicklungsmarker, SMI31, MBP und NeuN als neuronale Marker und CNP, GFAP und Iba1 als Gliamarker sichtbar gemacht. Die Infektion der Kulturen mit dem neurotropen Semliki-Forest-Virus betraf die Oligodendrozyten und die Neuronen. qRT-PCR-Untersuchungen der infizierten Zellen zeigten eine Hochregulation des chemotaktischen Zytokins Ccl5 mRNA in Kulturen, die mit Interferon beta behandelt wurden.
ELISA-Studien zeigten einen erhöhten Ccl5-Spiegel im Überstand und damit eine Korrelation zwischen mRNA und Proteinexpression. Durchflusszytometrische Untersuchungen der Einzelzellsuspension zeigten, dass 70 % der Zellen lebensfähig blieben. Eine große Anzahl von Mikroglia, Neuronen und Astrozyten war vorhanden, während Oligodendrozyten am wenigsten häufig vorkamen.
