Beginnen Sie mit dem Absaugen des Mediums von den Platten, die anhaftendes Rohmaterial 264.7 enthalten. Fügen Sie 10 Milliliter PBS pro 15-Zentimeter-Platte hinzu. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu lösen und in ein einziges 50-Milliliter-Röhrchen zu ziehen.
Pipettieren Sie die Zellsuspension auf und ab, um sie zu homogenisieren. Als nächstes werden 5 % des Volumens der Zellsuspension in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Bei 300 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren.
Entsorgen Sie den Überstand und legen Sie das gesamte Zellfraktionspellet auf Eis. Nachdem Sie die verbleibende Suspension wie zuvor beschrieben zentrifugiert haben, saugen Sie den Überstand ab und suspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern eiskaltem Mitochondrienpuffer erneut. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 300 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.
Suspendieren Sie das Pellet erneut in 0,5 Milliliter kaltem mitochondrialem Puffer. Und geben Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes homogenisieren Sie die Suspension und umgehen Sie sie 30 Mal durch eine 25-Gauge-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze angebracht ist.
Dann einen Milliliter kalten Mitochondrienpuffer in das Röhrchen geben und durch Inversion mischen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen wird ein Milliliter des Überstandes in ein frisches Röhrchen auf Eis überführt. Suspendieren Sie das Pellet erneut im Puffer und homogenisieren Sie das Pellet, indem Sie es durch eine 25-Gauge-Nadel führen, die an einer Ein-Milliliter-Spritze angebracht ist.
Ziehen Sie die homogenisierten Zellpellets und den Überstand aus den vorherigen Schritten in ein einziges 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 2.000 G bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und teilen Sie ihn in vier 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Erhöhen Sie das Volumen in jedem Röhrchen mit mitochondrialem Puffer auf 1,5 Milliliter. Drehen Sie die Röhrchen um, um ihren Inhalt zu mischen, und zentrifugieren Sie dann die Röhrchen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und das obere weiße Zellpellet.
Bewahren Sie eines der vier Röhrchen mit dem braunen mitochondrialen Pellet als rohe mitochondriale Fraktion auf Eis auf. Ziehen Sie die restlichen Pellets in ein neues Röhrchen und machen Sie das endgültige Volumen mit Mitochondrienpuffer auf einen Milliliter. Mit Hilfe dieses Protokolls wurden Gesamtzellen und rohe mitochondriale Fraktionen aus der rohen 264,7 Makrophagenzelllinie und BMDM gewonnen.
Die Immunblutanalyse zeigte, dass die mitochondriale Citratsynthase in der Rohfraktion angereichert war. Proteine aus Zytosol, Plasmamembran, Zellkern, Lysosom und endoplasmatischem Retikulum verschwanden. Die Proteomanalyse ergab eine Anreicherung der Rohfraktion um mehr als das Zehnfache.
Die anderen sechs zellulären Kompartimente waren während der Reinigung erschöpft.
