Schalten Sie zunächst das Raumlicht aus. Wählen Sie Okular unter dem Okularbereich in der FlowView Software aus. Ändern Sie den Würfelrevolver in vier TRITC, und schalten Sie den Touchpanel-Controller aus, indem Sie in der Software unter der Hintergrundbeleuchtung des Touchpanel-Controllers auf "Aus" klicken.
Schalten Sie dann den Computerbildschirm aus. Öffnen Sie die Vorderseite der schwarzen Stoffabdeckung des Mikroskops. Nehmen Sie die 35-Millimeter-Glasbodenschale mit den Embryonen aus der Blackbox und stellen Sie sie auf den Mikroskoptisch.
Schalten Sie dann die Fluoreszenzbeleuchtung ein und verwenden Sie das Okular, um den gewünschten Embryo zu identifizieren. Bringen Sie es in den Fokus. Schließen Sie die schwarze Stoffabdeckung, um die Probe vor Licht zu schützen.
Schalten Sie den Computerbildschirm ein, um auf die Software zuzugreifen, mit der das Mikroskop gesteuert wird. Ändern Sie das Okular in der Software für die Bildaufnahme auf LSM. Führen Sie eine Laserablation bei nicht stimulierten Kontrollembryonen mit einem Wasserimmersionsobjektiv mit 25-facher Vergrößerung durch.
Klicken Sie im Toolfenster auf Bright Z, Sequence Manager und LSM-Stimulation. Legen Sie den Scannertyp auf Galvano und die Scangröße auf 512 x 512 fest. Schalten Sie Kanal eins und Kanal drei unter dem PMT-Einstellungsfeld ein, um die Verwendung des 1040-Nanometer-Lasers zu ermöglichen, und klicken Sie auf die vierfache Live-Geschwindigkeit, um den Embryo zu visualisieren.
Drehen Sie den Embryo mit der Rotationsfunktion, um die vordere hintere Achse vertikal auszurichten, und stellen Sie den Zoom auf drei. Zeichnen Sie einen Interessenbereich oder eine ROI mit dem Formwerkzeug unter Scaneinstellungen und legen Sie die ROI-Größe im Referenzfenster fest. Legen Sie als Nächstes die ROI auf 512 Pixel in der Breite und 100 Pixel in der Höhe fest.
Um die Akquisitionsparameter für den Z-Stapel vor der Ablation festzulegen, registrieren Sie die Oberfläche des Embryos als Null unter dem Z-Abschnitt. Stellen Sie den Anfang auf Null und das Ende auf 100 Mikrometer ein. Stellen Sie die Schrittweite auf zwei Mikrometer ein und aktivieren Sie den Z-Erfassungsmodus, indem Sie Z auf der Registerkarte "Reihe" aktivieren.
Stellen Sie mit der hellen Z-Funktion die Laserintensität von 1040 Nanometern so ein, dass sie linear von 3 % auf 7 % ansteigt. Speichern Sie die aktuelle Bildeinstellung als erste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im Sequenz-Manager auf LSM klicken. Um die Aufnahmeparameter für den Film vor der Ablation festzulegen, stellen Sie einen ROI von 512 x 512 Pixeln in der Nähe der ventralen Oberfläche des Embryos ein, wie zuvor gezeigt. Stellen Sie die Laserintensität von 1.040 Nanometer auf 3 % ein, überprüfen Sie die Zeit, und deaktivieren Sie Z unter dem Reihenfeld.
Behalten Sie das Intervall unter dem Zeitrafferbereich als freien Lauf bei, und stellen Sie den Zyklus auf 10 ein. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im Sequenz-Manager auf LSM klicken. Um die Parameter für die Laserablation einzustellen, definieren Sie einen 3D-Bereich direkt unter der Vitellinmembran.
Legen Sie den Anfang des Z-Stapels als Ebene und das Ende auf 20 Mikrometer tiefer fest. Stellen Sie die Schrittweite auf 1,5 Mikrometer ein. Schalten Sie Kanal zwei und Kanal vier unter dem PMT-Einstellungsfeld ein, um die Verwendung des 920-Nanometer-Lasers zu ermöglichen.
Stellen Sie die Intensität des Lasers auf 30 % ein und stellen Sie die Bildaufnahme mit dem Laser für einen einzelnen Z-Stapel innerhalb des definierten 3D-Bereichs ein. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im Sequenz-Manager auf LSM klicken. Um die Aufnahmeparameter für den Film nach der Ablation festzulegen, stellen Sie die Bildaufnahme für einen 100-Frame-Film mit einer Z-Ebene nach der Ablation mit den 1-, 040- und 920-Nanometer-Lasern ein.
Stellen Sie die Intensität der Laser auf 3 % und 0,3 % ein. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im Sequenz-Manager auf LSM klicken. Wählen Sie unter Erfassen die Sequenz aus. Ändern Sie den Datenspeicherpfad und den Dateinamen nach Bedarf.
Klicken Sie auf Bereit, warten Sie, bis die Software die Pipeline initialisiert hat, und klicken Sie dann auf Starten, um die Pipeline auszuführen. um eine Laserablation bei stimulierten Embryonen durchzuführen, Legen Sie die Akquisitionsparameter für den Z-Stapel vor der Ablation fest, wie er für die nicht stimulierten Embryonen gezeigt wird. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als erste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im Sequenz-Manager auf LSM klicken.
Um Parameter für die optogenetische Stimulation innerhalb eines definierten ROI festzulegen, ändern Sie den Zoom auf eins und wählen Sie einen ROI aus, der die ventrale Oberfläche des Embryos abdeckt. Schalten Sie die Detektoren von Kanal eins bis vier aus, klicken Sie auf LSM-Stimulation, deaktivieren Sie kontinuierlich innerhalb der Dauer und geben Sie 12 Sekunden ein. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im Sequenz-Manager auf Stimulation klicken.
Stellen Sie eine Wartezeit von drei Minuten nach der Stimulation ein, um eine vollständige Inaktivierung des Myosin- und apikalen F-Aktin-Abbaus sicherzustellen und eine statische Gewebemorphologie vor der Laserablation zu erreichen. Als nächstes stellen Sie die Aufnahmeparameter für den einzelnen Z-Ebenen-Vorablationsfilm ein, wie er für die nicht stimulierten Embryonen gezeigt wird, mit der Ausnahme, dass die 1, 040- und 920-Nanometer-Laser für die Bildaufnahme verwendet werden. Schalten Sie die Detektoren von Kanal eins bis Kanal vier ein.
Stellen Sie die Intensität der Laser auf 3 % und 0,3 % ein. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im Sequenz-Manager auf LSM klicken. Stellen Sie die Parameter für die Laserablation ein, wie sie für die nicht stimulierten Embryonen gezeigt wurden. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im Sequenz-Manager auf LSM klicken.
Stellen Sie die Aufnahmeparameter für den einzelnen Z-Ebenen-Film nach der Ablation ein, wie er für die nicht stimulierten Embryonen gezeigt wurde. Speichern Sie die aktuelle Einstellung als nächste Aufgabe der Pipeline, indem Sie im Sequenz-Manager auf LSM klicken. Wählen Sie unter Erfassen die Sequenz aus.
Ändern Sie den Datenspeicherpfad und den Dateinamen nach Bedarf. Klicken Sie auf Bereit und warten Sie, bis die Software die Pipeline initialisiert hat, und klicken Sie dann auf Starten, um die Pipeline auszuführen. Bei den nicht stimulierten Embryonen, die einer apikalen Konstriktion unterzogen wurden, reicherte sich Spaghetti-Kürbis-mCherry in der medialen apikalen Region an, während CRY2Rho, ein dominantes negatives mCherry, zytosolisch war.
In den stimulierten Embryonen wurde das CRY2Rho-dominante negative mCherry-Signal in der Plasmamembran lokalisiert, während das mediale apikale Signal von Spaghettikürbis-mCherry vollständig verschwand. Die Laserablation der nicht stimulierten Embryonen innerhalb der Einengungsdomäne führte zu einem schnellen Geweberückstoß entlang der vorderen Hinterachse, während die Laserablation bei den stimulierten Embryonen nicht zu einem spürbaren Geweberückstoß führte. Die Ablation wurde quantifiziert und hier gezeigt.
