Entnehmen Sie zunächst die verdaute und expandierte, archivierte oder frische klinische Gewebeprobe und fahren Sie mit der Antikörperfärbung fort, indem Sie sie in eine einzelne Vertiefung einer Zellkulturplatte mit sechs Vertiefungen legen. Waschen Sie die Probe dreimal mit PBS für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur. Je nach Probengröße werden 0,5 bis 2 Milliliter der Primärantikörper in den Färbepuffer gegeben, um das Gel ausreichend zu bedecken.
Über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend wird die Probe dreimal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur mit PBS gewaschen. Geben Sie die entsprechenden Sekundärantikörper hinzu und inkubieren Sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Färbepuffer Ihrer Wahl.
Waschen Sie die Probe wie zuvor gezeigt erneut und geben Sie 1 bis 2 Milliliter Polyethylenglykol auf die Probe in einer Sechs-Well-Platte. Die Probe wird drei Stunden lang bei Raumtemperatur mit Fluor 4-konjugiertem NHS-Ester gefärbt. Am Ende der Inkubation wird die Probe dreimal mit PBS gewaschen.
Um eine Lipidfärbung durchzuführen, nehmen Sie die expandierte Gewebeprobe, die dreimal in PBS gewaschen wird, tragen Sie einen herkömmlichen lipophilen Farbstoff auf, der 200-fach in 2 Millilitern 0,1 % Triton X-100 oder PBS für 72 bis 96 Stunden bei Raumtemperatur verdünnt ist, und waschen Sie ihn mindestens dreimal mit PBS. Um FISH durchzuführen, wird der Hybridisierungspuffer durch Kombination von 2 x SSC, 10 % Dextransulfat, 20 % Ethylencarbonat und 0,1 % Tween 20 hergestellt. Homogenisierte Gelproben werden 30 Minuten lang in einen auf 60 Grad Celsius vorgewärmten Hybridisierungspuffer gegeben.
Anschließend werden die Gelproben mit einem Hybridisierungspuffer mit 10 pikomolären FISH-Sonden gegen das Zielgen über Nacht bei 45 Grad Celsius inkubiert. Waschen Sie die Proben mit Stringency Wash Buffer zweimal für jeweils 15 Minuten bei 45 Grad Celsius und zweimal für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Probe dreimal 10 Minuten lang mit PBS und fahren Sie mit der Bildgebung fort oder lagern Sie die Probe in PBS plus 0,02 % Natriumazid bei 4 Grad Celsius.
Um das Gewebe vollständig auszudehnen und abzubilden, werden die in PBS vierfach expandierten Proben auf eine Sechs-Well-Speicherfolie mit Glasboden gebracht. Wenn die Probe weiter ausgedehnt wurde, schneiden Sie sie in kleinere Stücke. Tragen Sie 0,1 % Polylysin auf die Glasoberfläche auf.
Legen Sie die Probe auf den Objektträger und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit um das Gel herum mit einem Papierlabortuch, um eine Bewegung des Gels während der Bildgebung zu verhindern. Führen Sie anschließend eine Fluoreszenzbildgebung mit einem herkömmlichen Weitfeldmikroskop, einem konfokalen Mikroskop oder einem anderen Bildgebungssystem Ihrer Wahl durch. Nach der Bildgebung werden die Proben in PBS mit mindestens drei 10-minütigen Wäschen verkleinert, da die Langzeitlagerung in deionisiertem Wasser zu einer Verschlechterung des Fluoreszenzsignals führt.
Zum Schluss lagern Sie die Proben in PBS mit 0,02%igem Natriumazid bei 4 Grad Celsius. Konfokale Bilder von vollständig expandiertem Hirngewebe der Maus ermöglichten die Visualisierung von Proteinen sowie Zell- und Mitochondrienmembranstrukturen. Die Nukleinsäuren von formalem und fixiertem, in Paraffin eingebettetem humanem Lymphknotengewebe wurden ebenfalls identifiziert.
Nach einer 3,5-fachen Erweiterung des Nierenabschnitts zeigte sich der rissfreie expandierte Glomerulus. Eine unzureichende Verankerung oder Homogenisierung führte jedoch zu Rissen, Verzerrungen und dem Verlust markierter Ziele in einem anderen Nierenabschnitt.
