Beginnen Sie damit, mindestens 20 Hoden aus den Puppen von Anopheles-Mücken in sterilem PBS zu entfernen. Übertragen Sie die Hoden auf einen sauberen Objektträger mit einem frischen Tropfen PBS. Die Hoden werden mit P1000 gefilterten Spitzen oder der Spitze einer Seziernadel in eine Embryonenschale mit 3,7 % Formaldehyd in PBST übertragen.
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes waschen Sie die Hoden fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in PBST. Die Hoden werden in die Embryonale mit RNase A überführt und eine halbe Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.
Entfernen Sie die RNA-Lösung und fügen Sie einen Milliliter der Penetrationslösung hinzu. Die Hoden werden 10 Minuten lang in der Penetrationslösung bei Raumtemperatur inkubiert. Waschen Sie dann die Hoden und PBST zweimal für jeweils fünf Minuten.
Die Hoden werden mit der markierten DNA-Sonde in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 20 bis 30 Mikrolitern Hybridisierungslösung überführt. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei 37 Grad Celsius im Dunkeln, um eine Hybridisierung zu ermöglichen. Übertragen Sie die Hoden mit Hilfe der gefilterten Spitze AP 1000 mit weißer Bohrung in eine Embryoschale und waschen Sie sie dann fünf Minuten lang in zwei XSSC.
Entfernen Sie den SSC und montieren Sie die Hoden auf einem Milchglasobjektträger mit einem handelsüblichen Eindeckmedium, das DAPI enthält. Versiegeln Sie den Objektträger mit einem Deckglas und inkubieren Sie ihn zwei Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Ein guter Grad an Hybridisierung ermöglichte die Visualisierung der Zielchromosomen während der gesamten Spermatogenese.
Die Paarung der markierten Geschlechtschromosomen konnte im präbiotischen und myotischen Stadium beobachtet werden. X- oder Y-tragende Spermatiden konnten während der gesamten Spermiogenese verfolgt werden, die durch unterschiedliche Stufen der DNA-Kondensation bis zum letzten Schritt der pfeilförmigen reifen Spermien gekennzeichnet war.
