Beginnen Sie mit der Herstellung von Stammlösungen aller Antikörper mit 2.000 Mikrogramm pro Milliliter. Beschriften Sie dann für jeden Antikörper die Verdünnungsröhrchen mit ihren jeweiligen Konzentrationen, einschließlich des Namens des Antikörpers. Fügen Sie auch ein Blindröhrchen für jeden Antikörper als PBS-TBN-Vehikelkontrolle hinzu.
Als Nächstes werden 75 Mikroliter PBS-TBN in alle Antikörper-Verdünnungsröhrchen gegeben, die mit 500 Mikrogramm pro Milliliter und darunter gekennzeichnet sind, einschließlich der Kontrollröhrchen, die nur für Fahrzeuge bestimmt sind. Für jeden Antikörper werden 150 Mikroliter der Stammlösung in das mit 1.000 Mikrogramm pro Milliliter gekennzeichnete Röhrchen pipettiert. Um eine vollständige Verdünnungsreihe für jeden Antikörper zu erstellen, übertragen Sie 75 Mikroliter aus dem Röhrchen mit 1.000 Mikrogramm pro Milliliter in die nachfolgende niedrigere Verdünnung in der Serie.
Danach verschließen Sie das neu fertiggestellte Verdünnungsröhrchen und wirbeln Sie es kurz vor. Dann werden 25 Mikroliter verdünnte Antikörper in die dafür vorgesehenen Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben, gefolgt von der Zugabe von 25 Mikrolitern biotinyliertem rekombinantem humanem PDL1 in jede Reaktionsvertiefung. Die Mikrotiterplatte mit einer Folie oder einem Kunststoffklebesiegel abdecken und eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln auf einem Orbitalplattenschüttler bei 600 U/min inkubieren.
Als nächstes werden die rekombinanten humanen PD1-gekoppelten Kügelchen mit PBS-TBN auf eine Konzentration von 50.000 Kügelchen pro Milliliter verdünnt. Entfernen Sie die 96-Well-Mikrotiter-Reaktionsplatte aus dem Schüttler und ziehen Sie die Klebeplattendichtung ab. Geben Sie 50 Mikroliter der rekombinanten humanen PD1-gekoppelten Bead-Mischung in jede Vertiefung.
Verschließen Sie die Platte fest und inkubieren Sie sie eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur auf einem auf 600 U/min eingestellten Orbitalschüttler. Entfernen Sie nach der Inkubation vorsichtig die Klebeplattendichtung. Legen Sie dann die Platte für zwei Minuten auf den magnetischen Plattentrenner, um die Perlen zu immobilisieren.
Vergewissern Sie sich, dass der Magnet und die Mikrotiterplatte fest miteinander verbunden sind. Drehen Sie den Teller um und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Um die überschüssigen Reaktionsreagenzien von den Kügelchen zu waschen, entfernen Sie die Mikrotiterplatte vom Magnetplattenseparator und geben Sie 150 Mikroliter PBS-TBN in jede Vertiefung.
Nachdem Sie die Versiegelung entfernt und die Kügelchen wie gezeigt immobilisiert haben, vergewissern Sie sich, dass der Magnet und die Mikrotiterplatte gesichert sind, und entleeren Sie den Überstand. Geben Sie nun 100 Mikroliter SAPE-Arbeitslösung in jede Reaktionsvertiefung und resuspendieren Sie die Kügelchen durch Pipettieren. Versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
Entfernen Sie dann vorsichtig die selbstklebende Plattenversiegelung, sobald die Perlen immobilisiert sind und Magnet und Platte miteinander verbunden sind. Entleeren Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie die Platte umdrehen. Um das überschüssige SAPE von den Kügelchen abzuwaschen, entfernen Sie die Mikrotiterplatte aus dem Magnetplattenhalter und geben Sie 150 Mikroliter PBS-TBN in jede Vertiefung, um die Kügelchen zu resuspendieren.
Immobilisieren Sie dann die Kügelchen, indem Sie die Mikrotiterplatte zwei Minuten lang auf einen magnetischen Plattenseparator legen. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass der Magnet und die Mikrotiterplatte befestigt sind, drehen Sie die Platte um und entfernen Sie den Überstand. Als nächstes geben Sie 100 Mikroliter verdünntes Brilliant Violet 421 konjugiertes Anti-Human- oder Anti-Kaninchen-Immunglobulin G in ihre jeweiligen Vertiefungen.
Versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Fixieren Sie dann die Perlen und entfernen Sie die Klebeplattenversiegelung. Vergewissern Sie sich, dass der Magnet und die Mikrotiterplatte befestigt sind, und entleeren Sie den Überstand.
Waschen Sie die überschüssigen sekundären Antikörper von den Kügelchen, indem Sie 150 Mikroliter PBS-TBN in jede Vertiefung geben, um die Kügelchen zu resuspendieren. Legen Sie dann die Mikrotiterplatte für zwei Minuten auf den magnetischen Plattenseparator, um die Kügelchen zu immobilisieren. Vergewissern Sie sich, dass der Magnet und die Mikrotiterplatte fest miteinander verbunden sind, und drehen Sie dann die Platte um und entleeren Sie den Überstand.
Sobald der vierte und letzte Waschpuffer entfernt ist, nehmen Sie die Mikrotiterplatte aus dem Magnetplattenabscheider. Resuspendieren Sie die Kügelchen mit einer Pipette in 100 Mikroliter PBS-TBN pro Well. Um schließlich die mittlere Fluoreszenzintensität jeder Reaktion zu bestimmen, lesen Sie die Platte auf dem Dual-Reporter-Durchflussanalysesystem ab, wobei das Aspirationsvolumen auf 50 Mikroliter, die minimale Anzahl der Kügelchen auf 100 Beads, die Timeout-Einstellung auf 40 Sekunden, der Gate-Bereich auf 7.000 bis 17.000 und der Betriebsmodus auf den Dual-Reporter eingestellt sind.
Alle vier polyklonalen Anti-PDL1-Peptid-Antikörper blockierten die rekombinante humane PDL1-Interaktion mit PD1. Der prozentuale Anteil der Hemmung der verschiedenen Anti-PDL1-Peptid-Antikörper lag zwischen 48 % und 74 % bei der maximal getesteten Konzentration von 1.000 Mikrogramm pro Milliliter. Der monoklonale Positivkontroll-Antikörper Atezolizumab erreichte bei der getesteten maximalen Konzentration von vier Mikrogramm pro Milliliter eine 92%ige Blockade der PD1-PDL1-Interaktion.
Eine vergleichende Bindungsanalyse von PDL1-Vax-induzierten Antikörperkandidaten gegen rekombinantes humanes PDL1 zeigte, dass alle vier polyklonalen Anti-PDL1-Peptid-Antikörper konzentrationsabhängig an rekombinantes humanes PDL1 binden. Der Anti-PDL1(130)-Antikörper zeigte das höchste RH-PDL1-Bindungssignal der vier PDL1-Vax-induzierten Antikörperkandidaten.
