Zu Beginn werden die betäubten Mäuse auf die chirurgische Plattform gelegt. Tragen Sie nach dem Trimmen der Haare Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Dann fixieren Sie die Mäuse zur Immobilisierung auf einem stereotaktischen Apparat.
Machen Sie einen kleinen Schnitt unter einem Mikroskop, um den Schädel vollständig freizulegen. Bereiten Sie zwei 10-Mikroliter-Spritzen vor, von denen eine AAV2/5-Adenosin-2A-Rezeptor-shRNA und die andere AAV2/5-Scramble enthält. Verwenden Sie dann das Mikroskop, um das Bregma und das Lambda zu lokalisieren, und legen Sie den Koordinatenpunkt auf der 10-Mikroliter-Spritze basierend auf dem stereotaktischen Atlas des Mäusegehirns fest.
Bohren Sie am festgelegten Koordinatenpunkt ein kleines Loch in den Schädel. Injizieren Sie zwei Mikroliter AAV2/5-Adenosin-2A-Rezeptor-shRNA-Virus durch laterale Injektion mit einer konstanten Geschwindigkeit von 100 Nanolitern pro Minute in die Hirnkammer. Halten Sie die Nadel 10 Minuten lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie zurückziehen.
Versiegeln Sie die verletzte Haut umgehend mit medizinischem Biofibrin-Kleber, um Virusverlust zu verhindern. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen und halten Sie ihre Körpertemperatur bei etwa 37 Grad Celsius, um die Erholung zu erleichtern. Injizieren Sie zwei Mikroliter CRE-TAT-Rekombinase in jeden Seitenventrikel der Arosa L-D-L-T-D-Tomatenmaus für die Versuchsgruppe und zwei Mikroliter steriles PBS für die Kontrollgruppe.
Zwei Wochen nach der CRE-TAT-Rekombinase-Injektion werden gefrorene Gewebeschnitte vorbereitet, eine Kernfärbung durchgeführt und der Objektträger für die Bildgebung vorbereitet Das Ausschalten des Adenosin-2A-Rezeptors im Aderhautplexus bei homozygoten Adenosin-2A-Rezeptor-Flussmäusen mit CRE-TAT führte zu verringerten klinischen EAE-Scores. In ähnlicher Weise verringerte das Ausschalten des Aderhautplexus bei Adenosin-2A-Rezeptor-Wildtyp-Mäusen mit AAV2/5-shRNA die klinischen EAE-Werte. Die QPCR-Analyse zeigte, dass die mRNA-Spiegel des Adenosin-2A-Rezeptors in den AAV2/5-shRNA- und CRE-TAT-Gruppen im Vergleich zu jeder Kontrolle abnahmen.
Das Ausschalten des Adenosin-2A-Rezeptors, insbesondere im Plexus choroideus, reduzierte die Infiltration von Immunzellen in das Rückenmark.
