Starten Sie zunächst die Bediensoftware des Mikroskops. Wählen Sie auf der Registerkarte "Setup" den richtigen vordefinierten Plattentyp aus. Drücken Sie auf Auswerfen, um auf den Plattentisch zuzugreifen und die Platte zu positionieren, und drücken Sie dann auf Laden, um die Platte in das Mikroskop zu laden.
Wählen Sie als Nächstes das 20-fache Luftobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,4. Stellen Sie den Korrekturring des 20-fach-Luftobjektivs auf die Plattendicke des gewählten Plattentyps ein. Stellen Sie die Kanalauswahl auf Hoechst 33342 ein, und passen Sie die Bildparameter für den Hoechst-Kanal an.
Testen Sie die gewählten Einstellungen, indem Sie eine repräsentative Vertiefung innerhalb der Platte auswählen. Wählen Sie im definierten Layout alle Plattenvertiefungen und Felder aus. Wählen Sie dann unter Online-Jobs den entsprechenden Ordner aus, um die Daten in die Online-Analyse-Software zu übertragen.
Die Experimenteinstellungen werden gespeichert. Auf der Registerkarte "Experiment ausführen" wird die Platte, die abgebildet werden soll, benannt und der Bildgebungsprozess gestartet. Um mit der Bildanalyse zu beginnen, starten Sie zunächst die Software, wählen Sie die zu analysierenden Bilder aus und klicken Sie dann auf die Registerkarte Bildanalyse, um die Bildsegmentierung zu starten.
Klicken Sie anschließend auf das Pluszeichen auf der Registerkarte Eingabebild, um einen neuen Baustein hinzuzufügen. Klicken Sie in der Liste auf Kerne suchen. Wählen Sie die am besten geeignete Segmentierungsmethode aus, nachdem Sie die segmentierten Objekte auf dem Bild untersucht haben.
Passen Sie die Erkennungsparameter innerhalb der Segmentierungsmethode an. Klicken Sie auf Ergebnisse definieren und wählen Sie als Methode die Standardausgabe aus. Klicken Sie auf Analyse in Datenbank speichern, um die Analyse-Pipeline zu speichern.
Klicken Sie auf der Registerkarte "Batch-Analyse" auf die gespeicherte Pipeline, die unter der Option "Methode" angezeigt wird. Wählen Sie dann die zu analysierenden Daten aus. Starten Sie die Analyse, indem Sie auf Analyse starten klicken, um den Datensatz für Zellnummern zu generieren.
Der beschriebene zellbasierte Assay beruht auf einer Reporterauslesung, die indirekt Änderungen der ATG4B-Aktivität widerspiegelt und den Nachweis sowohl von Inhibitoren als auch von Aktivatoren der ATG4B-Aktivität ermöglicht. Das Verhältnis der ATG4B-Aktivität jeder Verbindung zu ihrer Zellviabilität wird als Cutoff-Wert für die Identifizierung von ATG4B-Inhibitoren verwendet. Verhältnisse größer als eins weisen auf mögliche ATG4B-Aktivatoren und Verhältnisse kleiner als eins auf mögliche ATG4B-Inhibitoren hin.
