Halten Sie zunächst die Zellen in einem 75 Quadratzentimeter großen Kulturkolben. Saugen Sie das Nährmedium ab und spülen Sie die Zellen mit PBS ohne Kalzium und Magnesium. Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter 0,25%iges Trypsin EDTA hinzu, um die Adhärenzzellen zu lösen.
Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter Medium. Als nächstes werden die Zellen aus dem Kolben in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gesammelt. Bei 480 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und das Medium absaugen.
Resuspendieren Sie die Zellen in 5 bis 10 Milliliter Medium, basierend auf der ursprünglichen Konfluenz der Kultur. Entnehmen Sie 100 Mikroliter Zellen und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 100 Mikrolitern 0,4%igem Trypanblau. Geben Sie die Zellen in das Hämozytometer und zählen Sie sie, indem Sie sie unter dem Mikroskop beobachten und den manuellen Zählzähler verwenden.
Verdünnen Sie die Zellen auf dreimal 10 bis die vierte Zelle pro Milliliter im Nährmedium ohne Phenolrot. Geben Sie 2,5 Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit Poly-D-Lysin-beschichtetem Deckglas gemäß den Anweisungen des Herstellers. Züchten Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator, um die Zellbefestigung am Deckglas zu ermöglichen.
Untersuchen Sie am nächsten Tag die Zelladhäsion unter einem inversen Mikroskop mit einem 20X-Objektiv. Bereiten Sie die Behandlungsstammlösungen in den gewünschten Konzentrationen vor und erstellen Sie eine reine Medienkontrolle, eine reine Vehikelkontrolle mit einer Konzentration, die der Testverbindung entspricht, und eine Kontrolle mit dem Ionophor FCCP und den Testverbindungen. Arbeiten Sie mit jeweils einem Deckglas und geben Sie 1,8 Milliliter Medium für die Erkrankung, die Gegenstand der Studie ist, zu den Zellen.
Inkubieren Sie die Zellen, die entweder mit der Kontroll- oder Testverbindung bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid behandelt wurden, in einer befeuchteten Umgebung für die gewünschte Zeit. Geben Sie nach der Behandlungszeit 200 Mikroliter 10X TMRE zu den Zellen. 15 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Umgebung inkubieren.
Saugen Sie das Medium vorsichtig an und spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um Hintergrundstörungen zu minimieren. Drehen Sie dann das Deckglas auf einen Objektträger, der mit den Behandlungsbedingungen beschriftet ist. Stellen Sie sich vor, dass die Zellen bei 549 Nanometern Anregung und 575 Nanometern Emission leben.
Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um mehrere Z-Stapel-Felder mit Hochgeschwindigkeits-Bilderfassung zu erfassen, bevor die Zellintegrität verloren geht. Speichern und speichern Sie die Bilddatei für eine spätere Analyse. Die Zellen mit aktiven Mitochondrien behielten die TMRE-Färbung bei und zeigten eine hohe Fluoreszenz.
Depolarisierte oder inaktive Mitochondrien haben ein reduziertes Membranpotential, halten die TMRE nicht zurück und zeigen ein niedriges Fluoreszenzsignal.
