Um die Vesikelmembran zu färben, geben Sie den fluoreszierenden Lipidfarbstoff FM4-64 in einer Endkonzentration von zwei Mikromolaren zu den gereinigten Vesikeln und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang, bevor Sie ihn bildgeben. Nachdem die proteingefüllten Vesikel aus der Escherichia coli-Kultur isoliert wurden, pipettieren Sie die gereinigten Vesikel auf ein weniger als einen Millimeter dünnes, kreisförmiges 2%LB-Agarosepad, das sich bilden und auf einem sauberen Glasobjektträger abbinden konnte. Sobald die Flüssigkeit getrocknet ist, legen Sie einen 50 Millimeter mal 25 Millimeter großen Deckzettel über die Vesikel auf dem Pad.
Halten Sie das Deckglas mit Abstandshaltern und Klebeband fest. Montieren Sie dann den Objektträger mit einem Ölimmersionsobjektiv auf ein inverses Mikroskop und lassen Sie die Probe zwei bis drei Minuten ruhen, um sich zu beruhigen und die Temperatur auszugleichen. Verwenden Sie für Einzelbildbilder die Mittelwertbildung mit drei Bildern, um hardwareabhängige zufällige Hintergrundgeräusche zu reduzieren.
Planen Sie für Zeitrafferaufnahmen drei bis fünf Minuten zwischen den einzelnen Bildern ein. Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie zeigte die gereinigten Amniongrün-haltigen Vesikel. Der lipophile Fluoreszenzfarbstoff FM4-64 bestätigte das Vorhandensein von Vesikelmembranen.
Strukturierte Beleuchtungsmikroskopie der lebenden Bakterienzellen, die das innere Membranprotein CydB exprimieren, fusioniert mit Amniongrün und VNp6-mCherry2, zeigte die Vesikelproduktion und die Insertion von Fracht.
