Beginnen Sie mit der Inokulation der Kontroll- und rekombinationskompetenten Hefestämme aus YPD-Platten in fünf Milliliter YPR-Medium und lassen Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius und 200 U/min wachsen. Als Nächstes skalierst du die Kultur, indem du zwei Milliliter in 100 Milliliter frisches YPR-Medium impfst und es über Nacht bei 30 Grad Celsius und 200 U/min anbaust. Für jeden Stamm werden 1.800 Milliliter Peptonmedium der Autoklavenhefe und 200 Milliliter 20%Raffinoselösung im Autoklaven in zwei 5-Liter-Erlenmeyerkolben gegeben.
Jeder Hefestamm wird mit einer optischen Dichte von 0,2 bei 600 Nanometern in das jeweilige Medium inokuliert und etwa sechs Stunden lang bei 200 U/min inkubiert, oder bis die Zellen die gewünschte optische Dichte von 1,0 erreicht haben. Fügen Sie gleichzeitig 200 Milliliter 2%ige Galaktose und 110 Mikroliter Hefe-Paarungsfaktor Alpha oder YMFA hinzu, um die Zellen in der G1-Phase zu stoppen und zwei Stunden lang zu inkubieren. Die Zellsuspension wird in Ein-Liter-Zentrifugeneimer überführt und der Eimer 10 Minuten lang bei 6.000 g und vier Grad Celsius zentrifugiert.
Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 10 bis 15 Milliliter destilliertem Wasser. Als nächstes verschließen Sie eine 25-Milliliter-Spritze mit einem Köderpfropfen und legen sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das mit Wasser gefüllt ist. Übertragen Sie die Zellsuspension in die Spritzeneinheit.
Waschen Sie die Zentrifugeneimer mit fünf Millilitern destilliertem Wasser, um die restlichen Zellen aufzufangen. Dann zentrifugiert man die Baugruppe bei 2,397 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgt den Überstand. Entfernen Sie dann den Köderpfropfen von der Spritze und extrudieren Sie die Zellen in flüssigen Stickstoff, um Zellspaghetti zu bilden.
Zum Schluss werden die gefrorenen Zellspaghetti in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius gelagert.
