Beginnen Sie mit dem Abkühlen einer handelsüblichen Kaffeemühle, indem Sie etwa 30 bis 50 Gramm Trockeneis zweimal für jeweils 30 Sekunden mahlen. Entsorgen Sie das Trockeneispulver und mischen Sie drei Gramm gefrorene Hefezellenspaghetti mit ca. 30 bis 50 Gramm Trockeneis in der vorgekühlten Kaffeemühle. Versiegeln Sie die Verbindung zwischen der Kappe und dem Mahlwerk mit Parafilm.
Mischen Sie die Hefezellen-Trockeneismischung 10 Mal für jeweils 30 Sekunden, wobei Sie zwischen jeder Runde 30-Sekunden-Intervalle einhalten müssen. Das entstandene Trockeneispulver der Hefezelle mit einem sauberen und trockenen Spatel in ein Plastikbecherglas geben. Nach der Trockeneisverdampfung werden 2,25 Milliliter Magnetkügelchen oder MB-Puffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren in das Hefezellpulver gegeben.
Nach kräftigem Pipettieren der Zellpuffermischung wird die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Als nächstes lagern Sie 0,1 % der Proben aus den Rohzellextrakten für die DNA und 0,05 % der Proben für die Proteinanalyse bei minus 20 Grad Celsius. Die verbleibende Zellsuspension wird in zwei-Milliliter-Reaktionsröhrchen mit geringer Bindung überführt und durch Zentrifugieren der Röhrchen von Zelltrümmern getrennt.
Wenn Sie fertig sind, ziehen Sie alle Überstände in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Auch hier werden 0,1 % des Überstandes bei minus 20 Grad Celsius für DNA und 0,05 % des Überstands für die Proteinanalyse gelagert. Als nächstes werden 500 Mikroliter Immunglobulin-G-gekoppelte magnetische Bead-Aufschlämmung mit 500 Mikrolitern kaltem MB-Puffer, der Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthält, zweimal für jeweils fünf Minuten bei vier Grad Celsius bei 20 U/min gewaschen.
Inkubieren Sie die magnetischen Kügelchen in 500 Mikrolitern kaltem MB-Puffer für eine Stunde bei vier Grad Celsius bei Rotation mit 20 U/min, bevor Sie den Überstand mit einem Magnetgestell von den Kügelchen entfernen. Die äquilibrierte magnetische Kügelchenaufschlämmung wird mit dem zuvor erhaltenen Zelllysat vermischt und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen gezogen. Nach einer zweistündigen Inkubation bei vier Grad Celsius und 20 U/min wird die komplette magnetische Bead-Zelllysat-Suspension in Reaktionsröhrchen mit geringer Bindung überführt.
Trennen Sie die magnetischen Kügelchen, die die interessierenden Chromatinringe tragen, mit einem magnetischen Gestell vom Zelllysat. Übertragen Sie den verbleibenden Durchfluss aus jedem Röhrchen in ein frisches konisches 15-Milliliter-Röhrchen, bevor Sie einige Proben bei minus 20 Grad Celsius für DNA- und Proteinanalysen lagern. Als nächstes wird die magnetische Perle an jedem konischen 15-Milliliter-Röhrchen in 300 Mikroliter kaltem MB-Puffer aufgehängt und die Kügelchen zu einem Reaktionsröhrchen kombiniert.
Führen Sie fünf Wäschen von jeweils 10 Minuten mit 750 Mikrolitern kaltem MB-Puffer, der Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthält, bei vier Grad Celsius durch, während Sie mit 20 U/min rotieren. Als nächstes führen Sie die letzte Wäsche mit 750 Mikrolitern kaltem MB-Puffer ohne Protease- und Phosphatase-Inhibitoren durch. Die vorbereiteten Kügelchen werden in 40 Mikroliter kaltem MB-Puffer ohne Protease- und Phosphatase-Inhibitoren suspendiert.
