Freisetzung der lexA-CBP-Chromatin-Ringkomplexe aus den magnetischen Kügelchen, die zur Reinigung des Chromatin-Singlecopy-Genlocus verwendet werden, indem die Bienen mit zwei Mikrolitern 6xHis-markiertem rekombinantem Tabak-Etch-Virus oder TEV-Protease inkubiert werden. Nach der Trennung der Bienen vom fertigen Eluat mit Hilfe eines magnetischen Rack-Transfers wird das Eluat mit gespaltenem Chromatin in ein neues 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen geleitet. Legen Sie die Röhrchen wieder auf ein magnetisches Gestell, um die restlichen Kügelchen vom endgültigen Eluat zu trennen.
Resuspendieren Sie die Kügelchen in 750 Mikroliter kaltem Ammoniumcarbonat-Puffer, bevor Sie einige Proben bei 20 Grad Celsius für die DNA- und Proteinanalyse lagern. Entnehmen Sie die Proben aus dem endgültigen Eluat und lagern Sie sie bei 20 Grad Celsius für die DNA- und Proteinanalyse. Entnehmen Sie außerdem Proben von den Restperlen.
Beginnen Sie die Denaturierungselution, indem Sie die magnetischen Kügelchen zweimal in 750 Mikrolitern kaltem Ammoniumcarbonatpuffer für jeweils 20 Minuten waschen, wobei vier Grad Celsius mit 20 Umdrehungen pro Minute rotieren. Als nächstes werden 500 Mikroliter 0,5 molar Ammoniumhydroxid zu den Kügelchen gegeben, um gebundene lexA-Chromatinkomplexe zu extrahieren, und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Trennen Sie die Kügelchen mit einem magnetischen Gestell von der Suspension und überführen Sie das Eluat in ein Reaktionsröhrchen mit geringer Bindung.
Inkubieren Sie das Reaktionsröhrchen mit geringer Bindung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und trennen Sie die Kügelchen mit einem Magnetgestell von der Suspension. Wenn Sie fertig sind, überführen Sie das Eluat in ein Reaktionsröhrchen mit geringer Bindung. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 750 Mikroliter deionisiertem Wasser und sammeln Sie Proben für die DNA- und Proteinanalyse.
Zum Schluss entnehmen Sie DNA- und Proteinanalyseproben aus dem endgültigen Eluat. In der Studie wurde die Reinigungseffizienz des ARS316-Locus und des Rekombinationsstamms quantifiziert und mit dem Kontrolllocus PDC1 verglichen. Der ARS316-Locus zeigte im Vergleich zu PDC1 eine geringere Wiederfindung im Durchfluss.
Obwohl ein Teil der Chromatinringe aufgrund der unvollständigen TEV-Protease-Spaltung an die TEV-Kügelchen gebunden blieb, führte die Denaturierungselution zu einer Rückgewinnung von 80 bis 90 % ARS316-Locus. Dies entspricht der hohen Anreicherung von ARS316-Molekülen in TEV-Kügelchen und Denaturierungs-Elutionsfraktionen unter Berücksichtigung der Größe des Hefegenoms im Vergleich zum Kontrollstamm, der in keiner der quantifizierten Fraktionen eine Anreicherung des ARS316-Locus zeigte. Nach der TEV-Elution zeigten die Beads einen höheren Rückgewinnungsprozentsatz des ARS316-Locus, da die TEV-Spaltungseffizienz nicht 100 % betrug. Dies führte dazu, dass ein Teil der Chromatinringe an die Beads gebunden blieb.
Die denaturierende Elusion zeigte jedoch eine 80 bis 90%ige Wiederfindung des ARS316-Locus und des Rekombinationsstamms, die der hohen Anreicherung von ARS316-Molekülen unter Berücksichtigung der Größe des Hefegenoms entspricht.
