Beginnen Sie mit der Vorbereitung aller Reagenzien vor dem Experiment und tauen Sie die Basalmembranmatrix auf Eis auf. Bereiten Sie dann das murine Monolayer-Medium vor. Verdünnen Sie die aufgetaute Basalmembran eins zu 20 mit dem kalten murinen Monolayer-Medium und lassen Sie es auf Eis.
Platzieren Sie einen 0,4 Mikrometer großen transparenten Zellkultureinsatz mit einer sterilen Pinzette in eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Nimm einen Eckzacken des Einsatzes und führe ihn in die Vertiefung. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die entsprechende Anzahl von Zellkultureinsätzen für die Kultur zur Verfügung steht.
Um die apikale Oberfläche jedes Zellkultureinsatzes mit verdünnter Basalmembranmatrix zu bedecken, setzen Sie die Spitze der P 200-Pipette in die Mitte des Einsatzes und stoßen Sie 150 Mikroliter Matrix aus. Übertragen Sie die Platte dann für mindestens eine Stunde in einen sterilen 37-Grad-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Drehen Sie am Ende der Inkubation die 24-Well-Platte in einem 45-Grad-Winkel.
Legen Sie einen einzelnen Finger auf die Ecke der Krappe, um den Einsatz zu stabilisieren. Setzen Sie die Pipettenspitze P 200 vorsichtig an der Unterseite des Einsatzes entlang und entfernen Sie die Basalmatrix. Entfernen Sie überschüssige Rückstände, indem Sie jeden Zellkultureinsatz mit 150 Mikrolitern sterilem DPBS ohne Kalzium- oder Magnesiumionen waschen und mindestens 10 Minuten lang in einer biologischen Sicherheitswerkbank trocknen lassen.
Sobald die Einsätze getrocknet sind, geben Sie 400 Mikroliter des murinen Monolayer-Mediums auf den Boden und 75 Mikroliter auf den Zellkultureinsatz. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellkultureinsätze eingetaucht sind. Lassen Sie die Platte bis zur Verwendung in der biologischen Sicherheitswerkbank oder im Inkubator.
Nehmen Sie dann die 24-Well-Platte mit reifen Darmkolonoiden aus dem Inkubator und legen Sie sie unter die biologische Sicherheitswerkbank. Saugen Sie das Medium mit sterilen Spitzen an und waschen Sie jede Vertiefung mit einem Milliliter sterilem DPBS bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das DPBS mit sterilen Spitzen ohne Kalzium- oder Magnesiumionen.
Verdauen Sie jeden Pfropfen der Basalmembranmatrix, indem Sie 500 Mikroliter enzymatisches Dissoziationsreagenz in jede zu passierende Vertiefung geben. Um den Stecker aufzubrechen, drehen Sie die 24-Well-Platte in einem Winkel von 45 Grad. Platzieren Sie die Spitze der Pipette am Rand des Pfropfens und lösen Sie sie vorsichtig, indem Sie jeden Pfropfen etwa sechs- bis zehnmal pipettieren.
Legen Sie die 24-Well-Platte drei bis vier Minuten lang bei 37 Grad mit 5 % Kohlendioxid in einen sterilen Inkubator. Nach der Inkubation pipettieren Sie das Trypsin fünf- bis siebenmal für jede Vertiefung unter einer biologischen Sicherheitswerkbank auf und ab. Die dissoziierten Kolonoide aus jeder Vertiefung in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführen und mit einem eiskalten Mauswaschmedium auf ein Volumen von 10 Millilitern bringen.
Anschließend zentrifugieren Sie die teilweise verdauten Kolonoide bei 300 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius in einer Schwenkeimerzentrifuge. Unter der biologischen Sicherheitswerkbank den Überstand mit einer 10-Milliliter-Pipette aus dem Pellet entfernen. Entfernen Sie außerdem das restliche Medium mit einer P 200-Pipette.
Anschließend wird das Kolonoidpellet durch Zugabe von 75 Mikrolitern murinem Monolayer-Medium erneut suspendiert. Geben Sie 75 Mikroliter der Kolonoidsuspension in die Mitte jedes Zellkultureinsatzes. Pirigieren Sie die Suspension ein- oder zweimal vorsichtig, bevor Sie sie in die Vertiefung geben, um eine gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten.
Legen Sie die 24-Well-Platte mit Zellkultureinsätzen 10 Minuten lang auf eine rotierende Plattform, um eine gleichmäßige Verteilung über den Zellkultureinsatz zu ermöglichen, bevor Sie die Platte in einen sterilen 37 Grad Celsius heißen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator legen. Am Ende der Inkubation wurden die nicht anhaftenden Kolonoidfragmente gelöst, indem die Spitze neben das Innere der Zellkultur gelegt und das Medium drei- bis fünfmal mit einer P 200-Pipette pipettiert wurde. Vermeiden Sie es, die anhaftenden Darmzellen zu stören.
Entfernen Sie sofort die Mischung aus Medium und Dickdarm. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellkultureinsätze gereinigt sind. Geben Sie nun 150 Mikroliter vorgewärmtes murines Monolayer-Medium auf die apikale Seite jedes Zellkultureinsatzes.
Geben Sie 400 Mikroliter erwärmtes murines Monolayer-Medium in jede Vertiefung einer neuen 24-Well-Platte. Übertragen Sie den Zellkultureinsatz auf die neue Platte, indem Sie den Zinken mit einer sterilen Pinzette greifen. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis die gewünschte Konfluenz erreicht ist.
Die enzymatisch aufgebrochenen Kolonoide, die auf den Zellkultureinsätzen plattiert waren, traten zunächst in Zellclustern von 15 bis 150 Zellen auf. Am dritten Tag flachten die Zellen ab und bedeckten langsam den Zellkultureinsatz, wobei sie im Allgemeinen eine Konfluenz erreichten. In den nächsten Tagen wuchsen die Monolagen weiter und bildeten eine kontinuierliche Barriere, die quantitativ gemessen werden kann.
