Beginnen Sie damit, die präparierten Kniegelenke der Maus in eine Kulturschale zu legen. Saugen Sie das Nährmedium an und fügen Sie frisches Nährmedium hinzu. Wiederholen Sie das Waschen drei- bis viermal.
Verschieben Sie dann unter einem Stereomikroskop alle Fugen im Nährmedium, indem Sie sie mit einer feinen Pinzette ziehen. Entferne das Schienbein und so viele Gefäße, Sehnen und Bänder wie möglich und achte darauf, die Knochen nicht zu brechen. Bereiten Sie zwei 15-Milliliter-Röhrchen pro Probe vor.
Übertragen Sie mit einer Pinzette die ausgerenkten Knochen mit Weichteilen in das erste Röhrchen. Für jede Probe beider Hinterpfoten werden vier Milliliter Verdauungsmedium in das Röhrchen gegeben. Um Restzellen und Gewebefragmente zu sammeln, wird das Kulturmedium aus der Präparierschale in das zweite 15-Milliliter-Röhrchen überführt.
Zentrifugieren Sie das Medium bei 500 G für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Entfernen des Überstandes wird das Pellet mit einem Milliliter Aufschlussmedium resuspendiert. Und überführen Sie diese Lösung in das erste 15-Milliliter-Röhrchen, so dass es fast das gesamte Gewebe enthält, insgesamt fünf Milliliter Verdauungsmedium.
Anschließend wird die Probe für 60 bis 120 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Schütteln in einem Hybridisierungsofen aufgeschlossen. Nach der Inkubation wird die Probe durch Pipettieren gemischt und die Zelllösung durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen filtriert. Geben Sie 10 Milliliter Nährmedium durch das Zellsieb in das Röhrchen.
Bei 300 g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 10 Millilitern Nährmedium. Wiederholen Sie die Zentrifugation, verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet mit zwei Millilitern Nährmedium erneut.
