Bereiten Sie die Tiere auf den RNAi-Vererbungstest vor, indem Sie drei oder vier erwachsene Caenorhabditis elegans unter den 35-Millimeter-Standard-NGM-Platten auswählen, die mit OP50-1-Bakterien ausgesät sind. Waschen Sie nach vier Tagen die trächtigen erwachsenen Würmer von den Platten in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 800 Mikrolitern M9-Puffer, der mit Triton X-100 ergänzt wurde. Wiederholen Sie den Waschvorgang und ziehen Sie die Würmer in eine Röhre.
Nachdem Sie die Würmer 1,5 bis zwei Minuten lang bei 1.000 g zentrifugiert haben, saugen Sie den Überstand ab und lassen 100 Mikroliter übrig, ohne das Wurmpellet zu stören. In jedes Röhrchen, das das Wurmpellet enthält, 650 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzufügen. Um die C.elegans-Embryonen aus der gesammelten Population zu isolieren, fügen Sie 250 Mikroliter der frisch zubereiteten Bleichlösung hinzu und starten Sie einen Timer.
Alle ein bis zwei Minuten die Röhrchen gründlich vortexen. Überwachen Sie nach fünf Minuten den Abbau der erwachsenen Würmer unter dem Stereoskop. Fahren Sie mit dem Wirbel fort, bis sich die Würmer vollständig aufgelöst haben und nur noch Embryonen übrig bleiben.
Dies dauert in der Regel sechs bis sieben Minuten. Die Röhrchen werden sofort 1,5 Minuten lang bei 1.000 g zentrifugiert und der Überstand abgesaugt, wobei etwa 50 bis 100 Mikroliter des Überstandes bei den Embryonen verbleiben. Fügen Sie einen Milliliter M9-Puffer, ergänzt mit Triton X-100, zu den Embryonen und dem Wirbel hinzu.
Zentrifugieren Sie die Suspension und wiederholen Sie das Waschen zweimal. Nach der letzten Wäsche den Überstand absaugen und ca. 100 Mikroliter im Röhrchen belassen. Die Röhrchen mit isolierten Embryonen vortexen und zwei Mikroliter aus jedem Röhrchen zweimal auf einen beschrifteten Objektträger pipettieren.
Zählen Sie die Embryonen mit einem Zählzähler, um die Konzentration der Embryonen pro Mikroliter zu schätzen. Um ein halbsynchronisiertes Populationswachstum zu starten, werden etwa 250 Embryonen auf jede RNAi-NGM-Platte übertragen, die E.coli HT115-Bakterien mit GFP oder Kontroll-RNAi-Vektoren enthält. Lassen Sie die Flüssigkeit einziehen.
Die mit RNAi behandelte P-Null-Generation wird vier Tage lang bei 21 Grad Celsius inkubiert.
