Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Agarose-Pads, indem Sie einen Tropfen geschmolzene 1%ige Agarose mit einer Pasteur-Glaspipette auf die Schallplatte geben. Richten Sie einen Objektträger so aus, dass die Linien auf der Schallplatte horizontal oder vertikal sind, und legen Sie den Objektträger schnell für 30 Sekunden auf den Agarosetropfen. Nehmen Sie den Objektträger aus der Schallplatte und geben Sie etwa fünf Mikroliter frisch zubereitetes fünfmillimolares Levamisol unter das Stereoskop.
Schnippen Sie vorsichtig das Röhrchen mit den Würmern und geben Sie 5 bis 10 Mikroliter auf das Agarose-Pad, um die Würmer zu montieren. Schätzen Sie die Anzahl der Würmer, wenn sie hinzugefügt werden, so dass es ungefähr 40 Würmer pro Replikat gibt. Richte die Würmer mit einem Wimpernpickel in Reihen aus und lege ein Deckglas aus Glas auf den Objektträger.
Isolieren Sie die Embryonen von den verbleibenden Würmern mit dem Bleichprotokoll und platten Sie 250 Embryonen auf 35 Millimeter NGM-Platten, die mit OP50-1-Bakterien besiedelt sind. Verwenden Sie unter dem fluoreszierenden Stereoskop ein GFP-Filterset und zählen und notieren Sie die Anzahl der GFP-positiven und GFP-negativen Würmer auf den Objektträgern für jede Replikation mit einem Tally-Zähler. Die manuelle Bewertung des nukleären GFP-Signals in der Keimbahn für jede Generation zeigte, dass die Stummschaltung des Transgens in den mit GFP-RNAi behandelten P0- und F1-Würmern vollständig penetrant war.
In der F2-Generation betrug der Anteil der Bevölkerung, der eine Vererbung des GFP-Stummschaltens aufwies, etwa 50 %Bei der F5-Generation zeigte die Mehrheit der Bevölkerung keine Vererbung des Stummschaltens. In der F10-Generation exprimierten alle Würmer GFP und es wurde keine Vererbung festgestellt.
