Beginnen Sie mit der Positionierung einer euthanasierten Maus für die Augenenukleation mit einer gebogenen Pinzette, um das Gewebe um das Auge herum zu drücken, um das Auge aus der Augenhöhle zu verschieben. Heben Sie dann das Auge an, entfernen Sie es und übertragen Sie es in die frische PBS in der Präparierschiene. Schneiden Sie den Sehnerv mit einer ultrafeinen Schere so nah wie möglich am Augapfel ab und führen Sie vorsichtig eine feine Pinzette durch den Ausgang des Sehnervs an der Rückseite des Auges in den Augapfel ein.
Führen Sie nun eine Schere an der Rückseite des Auges ein und beginnen Sie mit einem Schnitt von der Rückseite in Richtung des Hornhaut-Sklera-Übergangs und setzen Sie den Schnitt fort, bis die Hälfte des Übergangs abgetrennt ist. Drücken Sie vorsichtig auf die Hornhaut, damit die Linse durch den Einschnitt austreten kann. Entfernen Sie mit einer geraden Pinzette vorsichtig große Gewebestücke von der Linse.
Nachdem Sie die Äquatorregion gefunden haben, stechen Sie die Linse flach ein und entfernen Sie dann die Linsenkapsel. Die Linsenfaserzellen werden mit 1 % Paraformaldehyd in eine 60-Millimeter-Schale überführt. Mit einem scharfen Skalpell teilen Sie die Kugel der Faserzellen entlang ihrer vorderen Hinterachse in zwei Hälften.
Und dann die Hälften entlang der gleichen Achse weiter schneiden, um Viertel herzustellen. Verwenden Sie die gerade Pinzette, um die Kernregion aus dem Zellviertel der Linsenfaser zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter 1%Paraformaldehyd zu einer 48-Well-Platte hinzu.
Übertragen Sie die Linsenrinde auf die Platte und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln bei 300 U/min. Nach der Blockierung werden geeignete Primärantikörper auf die 48-Well-Platte gegeben und die Proben in die Primärantikörperlösung überführt. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 Grad Celsius mit leichtem Schütteln oder Mutation.
Waschen Sie die Proben am nächsten Tag mit PTX und inkubieren Sie sie in ähnlicher Weise mit sekundären Antikörpern. Geben Sie nach dem Waschen der Proben einen Tropfen oder 50 Mikroliter Eindeckmedium auf einen gut geladenen Objektträger. Legen Sie das Gewebe in das Eindeckmedium.
Und verwenden Sie eine Pinzette, um die Faserzellen vorsichtig voneinander zu trennen. Legen Sie dann vorsichtig ein Deckglas auf die getrennten Zellen und Eindeckmedien. Nachdem Sie überschüssige Medien entfernt haben, verwenden Sie Nagellack, um die Kanten des Deckglases auf dem Objektträger vor der konfokalen Mikroskopie zu versiegeln.
Nach der Linsendissektion und dem Entfernen der Linsenkapsel wird die Faserzellmasse auf die nassen Fingerspitzen der Handschuhe übertragen und vorsichtig in alle Richtungen gerollt, um den Linsenkern zu trennen. Dann wird der Linsenkern in eine frisch hergestellte 1%ige Paraformaldehydlösung in einer 48-Well-Platte überführt und über Nacht bei 4 Grad Celsius unter leichtem Schütteln oder Mutation inkubiert. Am nächsten Tag wird die Probe in eine 60-Millimeter-Schale mit 1%Paraformaldehyd überführt und mit einem scharfen Skalpell der Linsenkern entlang der vorderen hinteren Achse in zwei Hälften und dann in Viertel geteilt.
Dann wird die Probe postfixiert, blockiert, gefärbt und montiert, wie zuvor gezeigt. Bei diesen Präparaten werden Bündel von Linsenfaserzellen mit einzigartiger Morphologie aus verschiedenen Linsenregionen gefunden. Die Färbung des F-Aktin-Netzwerks zeigt eine Anreicherung an der Zellmembran in differenzierenden und reifen Fasern, während F-Aktin-Signale im Zytoplasma von Kernfasern vorhanden sind. Rasterelektronenmikroskopie und konfokale Aufnahmen differenzierender Faserzellen zeigen Kugelgelenkverflechtungen mit kleinen, ineinandergreifenden Vorsprüngen, während reife Fasern Paddel haben, die mit kleinen Ausstülpungen verziert sind.
Rasterelektronenmikroskopie und konfokalmikroskopische Aufnahmen von Kernlinsenfaserzellen zeigen seltene und größere ineinandergreifende Vorsprünge an den kurzen Seiten der Zellen, wo die Zellmembran rau ist und Nut- und Federverflechtungen in diesen Zellen von der Mitte der Linse aus aufweist.
