Tragen Sie zunächst persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Augenschutz, eine chirurgische Maske und latexfreie Handschuhe. Bereiten Sie 20 Milliliter Maus-Neuroblastom- oder BHK-21-Zellen auf eine Konzentration von 3,0 mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter in EGM vor. Halten Sie die vorbereiteten Zellen kalt, bis sie gebrauchsfertig sind.
Als nächstes bereiten Sie das CVS-11-Virus vor, indem Sie es in EGM verdünnen. Stellen Sie sicher, dass das vorbereitete Virus bis zur Verwendung kalt bleibt. Reinigen Sie die Feuchtigkeits-Objektträgerkammer und die mit Polytetrafluorethylen beschichteten Objektträger mit 70 % Ethanol und lassen Sie sie in der Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen.
Geben Sie nach der Reinigung destilliertes Wasser zu den saugfähigen Papierstreifen in der Objektträgerkammer, um eine konstante Luftfeuchtigkeit während des gesamten Vorgangs zu gewährleisten. Beschriften Sie jede Folie mit einem Bleistift mit den erforderlichen Identifikationsinformationen, wie z. B. der Chargennummer, dem Datum und dem Zelltyp. Legen Sie die beschrifteten Objektträger zur Aufbewahrung in die Objektträgerkammer.
Tragen Sie dann 50 Mikroliter Virusverdünnung mit einer sich wiederholenden Pipette auf die Vertiefungen auf den Objektträgern auf. Tragen Sie 50 Mikroliter Zellverdünnung auf jede Vertiefung auf und achten Sie darauf, die Pipettenspitze nicht mit dem Virus zu kontaminieren, das sich bereits in der Vertiefung befindet. Danach verschließen Sie die Feuchte-Objektträgerkammer und stellen sie in den feuchten Inkubator zwischen 34 und 36 Grad Celsius.
Als nächstes entfernst du den Objektträger aus der Feuchtigkeitskammer und saugst den Überstand sorgfältig ab. Waschen Sie den Objektträger zwei Minuten lang in einem mit PBS gefüllten Coplin-Glas und lassen Sie ihn dann an der Luft trocknen. Legen Sie den Objektträger in ein mit kaltem Aceton gefülltes Coplin-Glas, um die Probe zu fixieren.
Stellen Sie das Glas mindestens eine Stunde lang in einen Gefrierschrank mit minus 20 Grad Celsius, der für brennbare Materialien zugelassen ist. Sobald das Aceton verdunstet und der Objektträger getrocknet ist, tragen Sie das direkte fluoreszierende Tollwut-Antikörperkonjugat auf die Vertiefungen des Objektträgers auf und inkubieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang in einem feuchten Inkubator bei 34 bis 36 Grad Celsius. Waschen Sie den Objektträger dann zweimal für jeweils zwei Minuten in einem Coplin-Glas PBS.
Trocknen Sie den Objektträger an der Luft und montieren Sie das Deckglas mit dem 0,05 molaren Triss, 0,15 molaren Natriumchlorid in 20%Glycerin-Eindeckmittel. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit 200-facher Vergrößerung, um die Zellinfektiosität zu bewerten. Als nächstes entfernst du die restlichen Objektträger aus dem Inkubator und der Feuchtigkeitskammer.
Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus jeder Vertiefung ab. Legen Sie die Objektträger dann für ein bis zwei Minuten in ein Coplin-Glas mit PBS. Lassen Sie die Objektträger etwa 30 Minuten an der Luft trocknen und lagern Sie sie dann bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius.
