Bereiten Sie zwei Keramikperlenröhrchen vor, indem Sie ein Zwei-Milliliter-PCR-Röhrchen mit einem ca. 200-Mikroliter-Röhrchen voller 1,4-Millimeter-Keramikkügelchen füllen und das Röhrchen entsprechend beschriften, bevor Sie sie in die sterile Haube überführen. Geben Sie die empfohlene Menge des im RNA-Extraktionskit enthaltenen Lysepuffers in das markierte PCR-Röhrchen. Entnehmen Sie mit einem Holzapplikator einen etwa drei Millimeter großen Würfel aus der Hirnprobe, bei der eine Tollwutinfektion bestätigt wurde, und geben Sie ihn in ein beschriftetes Röhrchen mit Proben-ID und 100 Mikroliter nukleasefreies Wasser in das Röhrchen mit der Bezeichnung Negativkontrolle.
Zerstören Sie das Hirngewebe manuell mit einem hölzernen Applikatorstäbchen und wirbeln Sie dann mit maximaler Geschwindigkeit vor, bis eine vollständige Homogenisierung des Gewebes erreicht ist. Als nächstes zentrifugieren Sie das homogenisierte Lysat. Den Überstand mit einer Pipette in ein neu markiertes Mikrozentrifugenröhrchen überführen und für weitere RNA-Extraktionsschritte, CDNA-Präparation und PCR-Amplifikation verwenden.
Nach der CDNA-Präparation und der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer-Pools A und B führen Sie eine PCR-Aufreinigung und Quantifizierung im Post-PCR-Bereich durch. Aliquot SPRI perlt aus der Hauptflasche in Mikrozentrifugenröhrchen. Diese können auch im Voraus vorbereitet werden.
Lagern Sie die Röhrchen bei vier Grad Celsius oder bewahren Sie sie in einem kalten Gestell oder Eis auf. Als nächstes wird die SPRI-Perle aliquot auf ca. 20 Grad Celsius erwärmt und gründlich vorgewirbelt, um die Kügelchen wieder in der gesamten Lösung zu suspendieren. Kombinieren Sie dann in den 1,5-Milliliter-Röhrchen die PCR-Produkte Primer Pool A und Primer Pool B für jede Probe.
Fügen Sie bei Bedarf Wasser hinzu, um das Volumen auf 25 Mikroliter zu bringen, bevor Sie 25 Mikroliter SPRI-Kügelchen zu jedem kombinierten Produkt hinzufügen und mischen. Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Umdrehen oder Schnippen der Röhrchen. Als nächstes legen Sie die Röhrchen auf ein magnetisches Gestell, bis sich die Kügelchen und die Lösung trennen.
Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie den Überstand, ohne das Kügelchenpellet zu stören. Dann zwei Wäschen à 30 Sekunden mit frisch zubereiteten 200 Mikrolitern 80%igem Ethanol durchführen und das Ethanol entsorgen. Entfernen Sie nach der zweiten Wäsche alle Spuren von Ethanol mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze.
Trocknen Sie das Pellet an der Luft, bis Spuren von Ethanol verdunstet sind und das Pellet von glänzend zu matt wird. Suspendieren Sie die Kügelchen erneut in 15 Mikroliter nukleasefreiem Wasser, um das gereinigte DNA-Produkt zurückzugewinnen, und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Trennen Sie die Kügelchen auf einem magnetischen Gestell von der Lösung.
Nachdem Sie den Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt haben, bereiten Sie eine bis 10-fache Verdünnung jeder Probe in nukleasefreiem Wasser vor. Messen Sie die DNA-Konzentration jeder verdünnten Probe mit einem hochempfindlichen und spezifischen Fluorimeter gemäß den Anweisungen des Herstellers.
