Beginnen Sie mit dem Ansaugen und Beladen der qualitätsgeprüften Durchflusszelle, indem Sie den Deckel des Sequenziergeräts zurückklappen und die Abdeckung des Ansauganschlusses im Uhrzeigersinn schieben, um den Ansauganschluss zu visualisieren. Um Luftblasen zu entfernen, stellen Sie eine P 1000 Pipette auf 200 Mikroliter ein und führen Sie die Pipettenspitze senkrecht in die Ansaugöffnung ein. Drehen Sie das Rad, bis ein kleines Volumen in die Pipettenspitze eintritt.
Laden Sie 800 Mikroliter vorgefertigte Durchflusszellen-Priming-Mischung über den Sauganschluss in die Durchflusszelle, um das Eindringen von Blasen zu vermeiden. Heben Sie die Abdeckung des Probenanschlusses an und füllen Sie 200 Mikroliter der verbleibenden Ansaugmischung über den Ansauganschluss in die Durchflusszelle. Um das Mischen der Ladeperlen zu gewährleisten, resuspendieren Sie den Bibliotheks-Mastermix durch Pipettieren und tropfenweise 75 Mikroliter über den Probenanschluss in die Durchflusszelle.
Setzen Sie die Abdeckung des Probenanschlusses vorsichtig wieder auf und stellen Sie sicher, dass der Spund in den Probenanschluss eindringt. Schließen Sie den Ansauganschluss und setzen Sie den Deckel des Sequenziergeräts wieder auf. Verwenden Sie für Live-Basisanrufe Rampart.
Verwenden Sie die Arctic RabV-Umgebung und arbeiten Sie in dem Verzeichnis, das für die Rampart-Ausgabe erstellt wurde. Geben Sie dann den Befehl Rampart ein, um zu den erforderlichen Pfaden zu navigieren. Zuerst das Rampart-spezifische Schemaprotokoll und die nächste Basis namens Pfad, der mino fastq Pass-Ausgabeordner für die Ausführung.
Öffnen Sie ein Browserfenster, und navigieren Sie im Feld URL zum lokalen Host 3000. Warten Sie, bis genügend Daten aufgerufen wurden, bevor die Ergebnisse auf dem Bildschirm angezeigt werden. In den oberen drei Bereichen werden Zusammenfassungsdiagramme für den gesamten Lauf angezeigt.
Diagramm eins zeigt die Tiefe der Abdeckung der kartierten Reads für jeden Barcode pro Nukleotidposition auf dem Index-Referenzgenom. Diagramm zwei zeigt zugeordnete Lesevorgänge von allen Barcodes im Zeitverlauf, und Diagramm drei zeigt zugeordnete Lesevorgänge pro Barcode. Die unteren Felder zeigen Reihen von Plots pro Barcode.
Die linke Seite zeigt die Tiefe der Abdeckung der kartierten Reads pro Nukleotidposition auf dem Index-Referenzgenom. Die Längenverteilung der zugeordneten Lesevorgänge liegt in der Mitte. Der Anteil der Nukleotidpositionen auf dem Index-Referenzgenom, der im Laufe der Zeit eine 10-fache, 100-fache und 1000-fache Abdeckung der kartierten Reads erreicht, ist in der rechten Ecke zu sehen.
Verwenden Sie für die Herkunftszuordnung von Konsensussequenzen MadDog. Rufen Sie das MadDog-Repository von GitHub ab, um sicherzustellen, dass Sie mit der neuesten Version arbeiten. Erstellen Sie einen Ordner innerhalb des zuvor erstellten lokalen MadDog-Repositorys.
Fügen Sie im Ordner die fastA-Datei hinzu, die die Konsensussequenzen enthält. Fügen Sie dem Ordner außerdem eine Metadatendatei hinzu. Stellen Sie sicher, dass es sich bei dieser Datei um eine CSV-Datei mit vier Spalten namens ID, Land, Jahr und Zuweisung handelt.
Rufen Sie das MadDog-Repository von GitHub ab, um sicherzustellen, dass Sie mit der neuesten Version arbeiten. Aktivieren Sie in der Befehlszeilenschnittstelle die Conda-Umgebung mit dem Befehl conda activate MADDOG. Navigieren Sie in der Befehlszeilenschnittstelle zum MadDog-Repository-Ordner.
Führen Sie zunächst eine Herkunftszuweisung für Sequenzen durch, um nach potenziellen Anomalien zu suchen und zu ermitteln, ob das Ausführen des Schritts zur längeren Herkunftsbezeichnung durch Ausführen der sh-Zuweisung geeignet ist. sh-Befehl. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie Y ein, um zu bestätigen, dass das Repository abgerufen wird und mit der neuesten Version von MadDog funktioniert.
Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie den Namen des Ordners ein, der die fastA-Datei im MadDog-Repository enthält. Wenn die Herkunftszuweisung abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Ausgabedatei im Ordner. Wenn die Ausgabe wie erwartet ist und mehrere Sequenzen derselben Herkunft zugewiesen sind, führen Sie die Herkunftsbezeichnung aus.
Löschen Sie beim Ausführen der Herkunftsbezeichnung die soeben erstellte Zuweisungsausgabedatei. Führen Sie im Terminal im MadDog-Repository-Ordner den Befehl sh designation.sh aus. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie Y ein, um anzugeben, dass das Repository abgerufen wird und die Arbeit mit der aktuellsten Version von MadDog ausgeführt wird.
Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie den Ordnernamen im MadDog-Repository-Ordner ein, der die fastA-Datei und die Metadaten enthält. Der Workflow von der Probe zur Sequenzierung bis zur Interpretation des Tollwutvirus RABV wurde erfolgreich unter verschiedenen Laborbedingungen in endemischen Ländern wie Tansania, Kenia, Nigeria und den Philippinen eingesetzt. Der Live-Base-Aufruf mit Rampart zeigte die Echtzeit-Generierung von Lesevorgängen und die prozentuale Abdeckung pro Probe.
Ein Abstammungsklassifikations- und Nomenklatursystem, MadDog, das zur Zusammenstellung und Interpretation der resultierenden RABV-Sequenzen verwendet wurde, zeigte die höher aufgelöste Klassifikation lokaler Abstammungslinien nach der MadDog-Zuweisung.
