Bereiten Sie zunächst das Gerät vor, indem Sie das hochauflösende Respirometer einschalten und es zur Datenerfassung und -analyse an die Respirometrie-Software VatLab anschließen. Ersetzen Sie das 70%ige Ethanol in der Oxygraphenkammer durch doppelt destilliertes Wasser. Rühren Sie es mit einem magnetischen Rührstab kontinuierlich mit 750 U/min in der Kammer um.
10 Minuten stehen lassen und dann das Wasser absaugen. Waschen Sie die Kammer dreimal mit doppelt destilliertem Wasser für jeweils fünf Minuten. Um die Sauerstoffsensoren zu kalibrieren, wird zunächst das doppelt destillierte Wasser entnommen und zwei Milliliter des Zellvorbereitungsmediums in die Kammer pipettiert.
Setzen Sie die Stopfen so auf, dass eine Luftaustauschblase entsteht. Um die Sauerstoffkalibrierungswerte aufzuzeichnen, passen Sie die Einstellungen wie Verstärkung für den Sensor, Polarisationsspannung und Datenaufzeichnungsintervall an. Beschriften Sie dann das Experiment und geben Sie das Medium ein.
Klicken Sie auf das Layout und wählen Sie 01 Calibration Experiment GR3 Temp. Rühren Sie das Medium mit dem Rührstab bei 750 U/min für mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und überwachen Sie die Leistung der Sensormembran. Halten Sie die linke Maustaste und die Umschalttaste gedrückt und ziehen Sie die Maus, um einen Bereich auszuwählen, in dem die Änderung der Sauerstoffkonzentration stabil ist.
Klicken Sie dann auf Oxygraph und dann auf O2-Kalibrierung. Ändern Sie bei der Luftkalibrierung die ausgewählte Markierung in den zuvor ausgewählten Bereich. Klicken Sie dann auf Kalibrieren und in die Zwischenablage kopieren.
Stoppen Sie die Aufnahme und speichern Sie mit einem Klick auf Oxygraph. Gefolgt von OK Control und dann speichern und trennen Sie die Verbindung. Um dann die Atemwege zu beurteilen, öffnen Sie die Kammer und saugen Sie das Medium im Inneren an.
Laden Sie die Samenzellen in ein Endvolumen von zwei Millilitern MRM für die permeabilisierte Zellanalyse. Laden Sie die Kalibrierung, indem Sie auf das POS-Kaliberfeld in der unteren Ecke doppelklicken und die zuvor durchgeführte Kalibrierung öffnen. Beenden Sie dann das Experiment.
Injizieren Sie 4,5 Mikroliter 10 Millimolar Digitonin und permeabilisieren Sie die Zellen für fünf Minuten. Zeichnen Sie die Atmung der intakten Zellen mindestens fünf Minuten lang auf, bis ein stabiles Signal vorliegt. Dann fügen Sie die Substrate für Komplex I oder Komplex II hinzu.Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal ansteigt und sich stabilisiert.
Als nächstes injizieren Sie fünf Mikroliter 0,5 molar ADP und messen den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal ansteigt und sich stabilisiert. Fügen Sie einen Mikroliter von vier Milligramm pro Milliliter Oligomycin hinzu, das ein ATP-Synthetase-Hemmer ist. Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal abnimmt und sich stabilisiert.
Titrieren Sie durch Zugabe von einem Mikroliter FCCP in aufeinanderfolgenden Schritten, beginnend mit 0,1 Millimolar bis zu einem Millimolar, bis eine maximale entkoppelte Atmungsrate erreicht ist. Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal ansteigt und sich stabilisiert. Hören Sie auf, das Medikament zu injizieren, wenn der Sauerstoffverbrauch zu sinken beginnt.
Zum Schluss injizieren Sie einen Mikroliter eines millimolaren Rotenons für Komplex I oder fünf millimolare Antimycin A für Komplex II, um zwischen dem mitochondrialen und dem Restsauerstoffverbrauch zu unterscheiden. Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal abnimmt und sich stabilisiert. Um eine Datenanalyse durchzuführen, wählen Sie Regionen aus, in denen der korrelierte Sauerstofffluss pro Volumen nach der Injektion eines Substrats oder Inhibitors stabil ist, klicken Sie auf Markierungen, dann auf Statistikfenster und exportieren Sie die Daten.
Normalisieren Sie die erhaltenen Daten pro 1 Million Samenzellen und subtrahieren Sie den nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch von allen Werten. Berechnen Sie die Indizes mit diesen Gleichungen. Die erfolgreiche Erfassung von intakten Samenzellen aus einer Samenprobe wurde erreicht, wobei die blaue Linie die Sauerstoffkonzentration und die rote Linie den Sauerstofffluss pro Volumen darstellte.
Eine niedrigere Anzahl von Spermien führte zu einem geringeren Sauerstoffverbrauch zu Studienbeginn. Darüber hinaus wurden mit diesem Protokoll Sauerstoffverbrauchskurven speziell für den mitochondrialen Komplex I oder Komplex II erhalten.
