Nach der Isolierung einzelner Kerne aus gefrorenem Säugetiergewebe wird die runde Folie auf der Dissoziatorkartusche vorsichtig mit einer Pipettenspitze durchstochen. Um die Reinigung des Saccharosegradienten zu erleichtern, nehmen Sie 900 Mikroliter der Kernsuspension aus der Kartusche und geben Sie sie zu 500 Mikrolitern Saccharosekissenlösung oder SCS, die in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen zubereitet wird. Durch Pipettieren gut mischen, bis die Mischung homogen ist.
Halten Sie dann das Röhrchen in einem Winkel und geben Sie vorsichtig 1.400 Mikroliter Kernsuspension SCS-Gemisch tropfenweise auf neue 500 Mikroliter SCS, wodurch eine deutlich sichtbare Phasentrennung entsteht. Verschließen Sie das Röhrchen vorsichtig und legen Sie es wieder auf das Eis, ohne die Phasentrennung zu stören. Die Röhrchen werden vorsichtig bei 13.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius in einer vorgekühlten Zentrifuge geschleudert.
Entfernen Sie den Überstand, ohne die Palette zu stören, und suspendieren Sie die Palette vorsichtig in 50 Mikroliter eiskaltem NSR. Ziehen Sie die beiden Paletten derselben Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. 900 Mikroliter eiskaltes NSR zu einem Gesamtvolumen von einem Milliliter geben und durch Pipettieren gut vermischen.
Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius mit einer Rotorzentrifuge mit schwingender Schaufel. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikroliter PBS. Zur Zählung werden 10 Mikroliter Kernsuspension in 20 Mikroliter PBS verdünnt.
Geben Sie 25 Mikroliter Propidiumiodid-Färbelösung in eine Mischvertiefung der fluoreszierenden Zählplatte. Dann fügen Sie 25 Mikroliter verdünnte Kernsuspension hinzu und mischen Sie sie gut durch Pipettieren. 50 Mikroliter der gefärbten Probe aus der Mischvertiefung in die Beschickungsvertiefung überführen.
Legen Sie die Zählplatte auf den Zellenzähler und starten Sie die Zählung. Nach der Zählung werden die Proben mit PBS auf die gewünschte Konzentration für die RNA-Sequenzierung einzelner Kerne verdünnt. Mit Hilfe des teilautomatisierten Protokolls zur Isolierung von Zellkernen wurden Kerne von guter Qualität ohne Anzeichen von Blasen, Ablagerungen oder Verklumpungen erhalten.
Es werden Geigendiagramme gezeigt, die die Verteilung der Genzahl, der UMI-Anzahl und des Mitochondriengehalts in jeder Probe darstellen. Die erwarteten Zelltypen aus jedem Gewebe wurden identifiziert, und alle Tiere trugen zu allen Clustern bei, was auf eine geringe technische Variabilität hindeutet, die durch das Protokoll eingeführt wurde. Darüber hinaus waren die zellulären Anteile, UMI-Zählungen und Genzahlen in allen drei Proben pro Gewebetyp vergleichbar.
