Beginnen Sie damit, einen Tropfen gebrauchsfertiger Blockierungslösung mit Eselsserum auf die Gewebeproben zu pipettieren. Anschließend werden die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Entfernen Sie die überschüssige Blockierungslösung von den Objektträgern, indem Sie die Kante gegen eine harte Oberfläche klopfen.
Verdünnen Sie die primären Antikörper im Antikörperverdünnungspuffer, um für jede Probe 100 Mikroliter der endgültigen Lösung herzustellen. Richten Sie die Antikörper ein, ein Röhrchen für jeden Primärantikörper und eines für jeden Isocontrol-Antikörper. 100 Mikroliter Isokontrollantikörper gleichmäßig auf eine Probe und 100 Mikroliter Myeloperoxidase und citrulliniertes Histon H3 oder Myeloperoxidase und neutrophile Elastase-Antikörperverdünnung auf die andere Probe verteilen.
Legen Sie die Objektträger in eine Nasskammer und lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag klopfen Sie überschüssige Primärantikörperlösung von den Objektträgern ab und stapeln Sie sie in einer Küvette. Spülen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween, um die verbleibende primäre Antikörperlösung zu entfernen.
Bereiten Sie zwei deutlich fluoreszierende Sekundärantikörper vor, Donkey Anti-Goat für Myeloperoxidase und Donkey Anti-Rabbit für die citrullinierte Histon H3-Färbung. Verdünnen Sie jeden Antikörper auf 7,5 Mikrogramm pro Milliliter Konzentration im Antikörperverdünnungspuffer. Legen Sie die Objektträger in eine Nasskammer und geben Sie 100 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung auf jede Probe.
Inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. Entfernen Sie überschüssige sekundäre Antikörperlösung, indem Sie auf die Objektträger tippen. Legen Sie die Objektträger in ein Objektträgerregal.
Tauchen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in ein mit PBS gefülltes Färbegefäß, um ungebundene Antikörper abzuwaschen. Bereiten Sie die Dappy Solution vor und verdünnen Sie sie mit deionisiertem Wasser auf eine Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter. Tauchen Sie das Objektträgergestell in ein Färbegefäß mit der Dappy Solution und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
Als nächstes tauchen Sie das Objektträgergestell fünf Minuten lang in ein Färbegefäß mit PBS, um überschüssige Dappy Solution abzuwaschen. Zum Schluss montieren Sie die Proben mit Deckgläsern und Eindeckmedium. Der citrullinierte Histon-H3-Antikörper bindet nur an die extrazellulären Histone und zeigte keine Färbung der intrazellulären Histone.
Der humane oder mausspezifische Myeloperoxidase-Antikörper zeigte keine spezifische Färbung. Während die universellen Antikörper von Mensch und Maus eine konsistent gute Färbung für die Myeloperoxidase zeigten. Wenn kein Blockierungsmittel verwendet wurde, zeigten einige Mausproben eine unspezifischere und teilweise positive Färbung.
Wenn sie blockiert wurde, zeigte die Blockierungszeit von fünf Minuten im Vergleich zu den 10 Minuten Blockzeit gute Ergebnisse. Die höheren Temperaturen in der Mikrowelle und im Wasserbad zeigten durchweg eine moderate bis gute Antigengewinnung. In einem 60 Grad Celsius warmen Wasserbad gab es dagegen nur teilweise positive bis gar keine Flecken.
Für die Doppelfärbung wurden günstigere Ergebnisse für die Proben erzielt, die bei 96 Grad Celsius Wasserbad inkubiert wurden. Eine Überschreitung der Inkubationszeit von 40 Minuten bei 96 Grad Celsius führte jedoch zu einer weniger intensiven Antikörperfärbung.
