Zu Beginn zentrifugieren Sie FBS über Nacht in einer Ultrazentrifuge bei 110.000 g und vier Grad Celsius, um die endogenen sEVs zu entfernen. Sterilisieren Sie den Überstand, indem Sie ihn durch eine 0,2-Mikron-Ultrafiltrationsmembran filtern, um sEVs-freie FBS zu erhalten. Als nächstes werden in einer 150-Millimeter-Kulturschale etwa 3 mal 10 bis zum siebten immortalisierten Makrophagen aus dem Knochenmark in 20 Milliliter DMEM-Kulturmedium eingeteilt.
Inkubieren Sie die Schale über Nacht bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid, bevor Sie die sEVs von den Makrophagen sammeln. Am nächsten Tag, nachdem Sie das Medium entsorgt haben, waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS. Ersetzen Sie das Medium durch DMEM, das 10 % sEVs-freies freies fötales Kälberserum enthält, bevor Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.
Basierend auf den Anforderungen des Experiments wird der Überstand der Zellen gesammelt und in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 300 g, um die Zellen zu entfernen. Das Ergebnis im Überstand aus jedem Röhrchen in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen und das Pellet entsorgen.
Diesmal zentrifugieren Sie den Überstand 10 Minuten lang bei 2000 g, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Füllen Sie dann den Überstand in neue Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen um und entsorgen Sie die Pellets. Um Ablagerungen und Mikrovesikel zu entfernen, zentrifugieren Sie den erhaltenen Überstand 30 Minuten lang bei 10.000 G mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge.
Übertragen Sie den entstandenen Überstand in neue Ultrazentrifugenröhrchen, indem Sie 35 Milliliter in jedes Röhrchen geben und die Pellets verwerfen. Zentrifugieren Sie die Ultrazentrifugenröhrchen in einer Rotorzentrifuge mit schwingender Schaufel bei 110.000 g für 70 Minuten, bevor Sie den Überstand entsorgen. Waschen Sie das resultierende rohe mit sEVs angereicherte Pellet mit einem Milliliter PBS.
Geben Sie erneut einen Milliliter PBS in das gewaschene Pellet in einem der Röhrchen und mischen Sie durch kontinuierliches Pipettieren. Geben Sie den einen Milliliter der resultierenden PBS-Suspension in ein anderes Röhrchen, das das Pellet enthält, und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Pellets in den Röhrchen durch Pipettieren vermischt sind. Übertragen Sie das resultierende ein Milliliter sEVs-reiches PBS in ein neues Ultrazentrifugenröhrchen.
Zentrifugieren Sie dann das neue Röhrchen in einer Tisch-Ultrazentrifuge bei 110.000 G für 70 Minuten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, waschen Sie das resultierende rohe mit sEVs angereicherte Pellet mit 100 Mikrolitern PBS. Geben Sie 1,2 Milliliter Proteinzubereitungslösung in ein Standard-Proteinröhrchen, um die darin enthaltenen 30 Milligramm BSA aufzulösen.
Verdünnen Sie die resultierende Proteinstandardlösung mit PBS, um ihre Konzentration von 25 auf 0,5 Milligramm pro Milliliter zu reduzieren. Geben Sie acht verschiedene Volumina der verdünnten Proteinstandardlösung in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte und bringen Sie das Volumen in jeder Vertiefung mit PBB auf 20 Mikroliter. Geben Sie 18 Mikroliter HEPES-Lysepuffer in die Probenvertiefungen, gefolgt von der Zugabe von zwei Mikrolitern der sEVs-Proben.
Als nächstes werden 200 Mikroliter BCA-Arbeitslösung, die gemäß den Anweisungen des Herstellers zubereitet wurde, in jede Vertiefung gegeben. Den Teller 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. Zum Schluss wird die Absorption bei 562 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader gemessen.
Berechnen Sie den Gesamtproteingehalt in den sEVs anhand der erhaltenen Ergebnisse. Die transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen der isolierten sEVs zeigten eine typische becherartige Morphologie. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse zeigte, dass die isolierten sEVs meist bei 136 Nanometern konzentriert waren.
Western Blot zeigte, dass isolierte sEVs signifikant mit sEVs-Markern wie CD9, Beta-Aktin und TSG101 angereichert waren. Der endoplasmatische Retikulatmarker GRP94 konnte nur im Ganzzelllysat nachgewiesen werden. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die angewandte Methode sEVs mit einem hohen Reinheitsgrad lieferte.
