Waschen Sie zunächst die isolierten kleinen extrazellulären Vesikel oder SEVs zweimal durch Ultrazentrifugation bei 110.000 g und vier Grad Celsius für 70 Minuten. Resuspendieren Sie die Vesikel in 500 Mikroliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS. Fügen Sie dann fünf Mikroliter 100X-Protease-Inhibitor hinzu.
Unterziehen Sie die Probe 10 Minuten lang einer Ultraschallzerkleinerung bei 40 Watt mit einer Ultraschallzeit von drei Sekunden und einer Intervallzeit von fünf Sekunden. Die zerkleinerte Mischung wird bei 13.700 g 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Zu dem erhaltenen Überstand wird Dithiothreitol in einer Endkonzentration von 50 Millimolar hinzugefügt.
Und im Wasserbad bei 56 Grad Celsius 30 Minuten inkubieren. Anschließend werden 50 Mikroliter eines molaren Jodacetamids in den Überstand gegeben. Und lassen Sie es bei Raumtemperatur 20 Minuten im Dunkeln reagieren.
Zentrifugieren Sie die Mischung bei 13, 700 g und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Und überführen Sie den Überstand, der den rohen Peptidextrakt enthält, in ein 10-Kilodalton-Ultrazentrifugenröhrchen. Entfernen Sie Protein aus dem Rohpeptid, indem Sie das Ultrafiltrationsröhrchen eine Stunde lang bei 13, 700 g und vier Grad Celsius zentrifugieren.
Trocknen Sie das gesammelte Abwasser in einem Vakuum-Zentrifugalkonzentrator bei 45 Grad Celsius. Verwenden Sie zum Entsalzen reines Wasser in Massenspektrometriequalität als Lösungsmittel für alle Reagenzien. Lösen Sie zunächst die trockenen Peptide in 100 Mikrolitern 0,1%iger Trifluoressigsäure oder TFA auf und stellen Sie sie beiseite.
Geben Sie dann 100 Mikroliter reines Acetonitril in jede Entsalzungssäule. Zentrifugieren Sie die Säulen bei 400 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur und entsorgen Sie das Abwasser. Dann fügen Sie 100 Mikroliter 50%iges Acetonitril pro Entsalzungssäule hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation wie zuvor erwähnt, bevor Sie das Abwasser entsorgen.
Als nächstes geben Sie 100 Mikroliter 0,1 % TFA in jede Entsalzungssäule, bevor Sie wie bereits erwähnt zentrifugieren. Entsorgen Sie das Abwasser noch einmal. Pipetieren Sie nun die Entsalzungspeptide in die Entsalzungssäule.
Zentrifugieren Sie die Säulen wie bereits erwähnt, um die Probe zu laden. Geben Sie das zurückgewonnene Abwasser wieder in die Entsalzungskolonne, um die Beladung zu wiederholen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter 0,1 % TFA hinzu.
Zentrifugieren Sie, wie bereits erwähnt, und entsorgen Sie das Abwasser. Zum Schluss werden 50 Mikroliter 50%Acetonitril mit 0,1%TFA zum Peptid in der Entsalzungssäule gegeben. Nach der Zentrifusion wird das Abwasser, wie bereits erwähnt, in einem neuen Zentrifugenröhrchen in Massenspektrometriequalität gesammelt.
