Beginnen Sie mit der Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes, indem Sie auf den menschlichen Buffy-Mantel zugreifen und sieben Milliliter in ein steriles konisches Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 Millilitern übertragen. Fügen Sie sechs Milliliter PBS-Lösung hinzu, um sie vorab zu waschen. Das Röhrchen wird 10 Minuten lang bei 1,100 g in einer Zentrifuge mit Schwenkrotor zentrifugiert und bei Raumtemperatur abgebremst.
Sammeln Sie die Leukozytensuspension mit einer Pasture-Pipette und überführen Sie sie in ein neues steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie PBS-Lösung in die Leukozytensuspension, bis sie 10 Milliliter erreicht, und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren auf und ab. Als nächstes wird die Dichtegradientenlösung hergestellt, indem drei Milliliter Dichtegradientenmedium in ein neues steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen gegeben werden.
Lassen Sie es Raumtemperatur erreichen. Geben Sie langsam fünf Milliliter verdünnte Leukozytensuspension auf die konischen Röhrchenwände, die das Dichtegradientenmedium enthalten, um eine Gradiententrennung von fünf bis drei Dichten zu erzeugen. Vermeiden Sie es, das Medium zu stören.
Fahren Sie mit der Gradiententrennung fort, indem Sie die im Dichtegradientenmedium vorhandene Suspension mit einer Zentrifuge mit Schwenkrotor zentrifugieren und die Bremse ausschalten. Als nächstes werden vorsichtig bis zu 25 Milliliter der dünnen PBMC-Schicht mit einer Weidepipette in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit PBS gefüllt und gut gemischt, um Restzellen und Ablagerungen zu entfernen, und die Proben bei Raumtemperatur 10 Minuten lang bei 600 G mit einer normalen Bremse zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und füllen Sie die Probe mit PBS auf 10 Milliliter auf.
Nehmen Sie ein Aliquot, um die Zellen zu zählen. Um die Blutplättchen zu entfernen, zentrifugieren Sie sie mit einer normalen Bremse und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um den Überstand zu entsorgen. Für die Isolierung von Monozyten-CD14-positiven Zellen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung wird das Zellpellet im Mikroperlenpuffer und in den immunmagnetischen CD14-Kügelchen resuspendiert.
Inkubieren Sie die Zellsuspension für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Um die ungebundenen Kügelchen zu entfernen, fügen Sie ein bis zwei Milliliter Mikrokügelchenpuffer pro Mal 10 zu den siebten Zellen hinzu, bevor Sie die Suspension bei Raumtemperatur für 10 Minuten bei 600 G zentrifugieren. Bereiten Sie die LS-Säule vor und legen Sie sie vor dem Gebrauch auf den Magneten.
Spülen Sie es mit drei Millilitern Mikrokügelchenpuffer ab und resuspendieren Sie das Zellpellet sofort in 500 Mikroliter Mikrokügelchenpuffer pro 10 mal 10 bis zur achten Zelle. Geben Sie die Zellsuspension in den LS-Säuleneinlass und sammeln Sie die negative Zellfraktion in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen unterhalb des Säulenauslasses. Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Millilitern Mikroperlenpuffer.
Nach der letzten Wäsche entfernen Sie die Säule vom Magneten und legen sie auf ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie fünf Milliliter Mikrokügelchen in den Säuleneinlass. Setzen Sie den mit den Zielzellen gefüllten Spritzenkolben sofort in den Säuleneinlass ein und dosieren Sie die Zellen in der Säule.
Zentrifugieren Sie dann CD14-negative und CD14-positive Zellfraktionen und verwerfen Sie den Überstand. Für die Monozytendifferenzierung in humane monozytenabgeleitete dendritische Zellen wird eine Zellsuspension hergestellt, die 1,3 mal 10 bis sechste Zellen pro Milliliter enthält, indem den CD14-positiven Zellen das entsprechende Volumen des Differenzierungsmediums zugesetzt wird. Resuspendieren Sie die Monozyten durch Pipettieren mit einer Weidepipette.
Nach dem Auftragen der 1,3 mal 10 bis sechsten Zellen pro Milliliter Suspension pro Well einer 24-Well-Platte wird in einem Kulturinkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Wechseln Sie das Nährmedium und ergänzen Sie es alle zwei bis drei Tage mit frischen Zytokinen. Um die differenzierten Zellen zu sammeln, wird die gesamte Zellsuspension mit einer Mikropipette in ein steriles konisches Röhrchen überführt und der Kulturkolben zweimal mit PBS gewaschen.
Nach dem Zentrifugieren der konischen Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten bei 180 G wird das Pellet in das geeignete Medium oder den entsprechenden Puffer für den Versuchsaufbau resuspendiert. Während der Monozytendifferenzierung veränderten Interleukin-vier und die Stimulation des Granulozyten-Makrophagen-stimulierenden Faktors den Zellphänotyp. Die Daten zeigten, dass humane monozytenbasierte dendritische Zellen die Expression des Oberflächenmarkers CD14 verloren, der hauptsächlich von Monozyten exprimiert wird, und eine signifikante Expression von CD1A erhielten.
Ein Marker, der von menschlichen dendritischen Zellen exprimiert wird. Humane Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen erhalten auch eine höhere Expression von MHC2 HLA-DR, einem Antigen-präsentierenden Molekül, das von menschlichen dendritischen Zellen und anderen Antigen-präsentierenden Zellen exprimiert wird.
