Treatment of the Monocyte-Derived Dendritic Cells (Mo-DCs) with Sialidase

Sammeln Sie etwa 10 mal 10 bis zur sechsten humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen, die von den Monozyten differenziert sind. Von den 10 Vertiefungen der 24-Well-Platte mit 1,3 mal 10 bis zur sechsten Zelle pro Well, überführen Sie sie in ein neues steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Nachdem die Zellen fünf bis sieben Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 g zentrifugiert wurden, entsorgen Sie den Überstand, um abgestorbene Zellen und Ablagerungen zu entfernen.

Geben Sie 10 Milliliter RPMI 1640 Medium mit 11,1 Millimolar Glukose in das Röhrchen. Nach dem Zentrifugieren bei Raumtemperatur für vier Minuten bei 300 G unter Verwendung der normalen Pause wird der Überstand wieder entsorgt. Geben Sie zwei Milliliter RPMI 1640 Medium in das Zellpellet und teilen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in zwei neue sterile Mikroröhrchen auf, die als Nummer eins und Nummer zwei gekennzeichnet sind.

In das erste Mikroröhrchen geben Sie 500 Millieinheiten Sialidase aus Clostridium perfringens. Beide Röhrchen 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation werden die Zellen aus beiden Mikroröhrchen in entsprechende neue konische 15-Milliliter-Röhrchen übertragen, die mit Nummer eins und Nummer zwei gekennzeichnet sind.

Geben Sie dann etwa vier Milliliter des vollständigen RPMI 1640-Mediums mit 10 % FBS in jedes konische Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen vier Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 G mit der normalen Pause und geben Sie fünf Milliliter des vollständigen RPMI 1640-Mediums in das Pellet. Verteilen Sie eine Milliliter-Zelle pro Well.

Die Wirksamkeit der Sailidase-Behandlung zur Reduzierung des Sialinsäuregehalts auf der Oberfläche von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen wurde durch Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie untersucht. Die Sailidase-Behandlung verringerte signifikant die Lektinbindung von Maackia Amurensis und Sambucus nigra und erhöhte gleichzeitig die Erdnuss-Agglutinin-Lektin-Färbung. Die Abnahme der Sambucus nigra Lektinfärbung nach Sailidase-Behandlung zeigte eine signifikant reduzierte Sambucus nigra Lektinfärbung an der Zelloberfläche.