Bereiten Sie zunächst 10 bis 20 Mikrogramm hochwertige Gesamt-RNA für die Isolierung von poly(A)angereicherter RNA vor. Ein Aliquot RNA wird in ein nukleasefreies 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang in einem Wärmeblock bei 70 Grad Celsius und legen Sie es dann für zwei Minuten auf Eis.
Nach der Resuspension der Oligo(dT)-Kügelchen wird das erforderliche Volumen der Kügelchensuspension in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und drei Minuten lang auf den Magneten gelegt, bis die Magnetkügelchen ein Pellet bilden. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie ein gleiches Volumen Lysepuffer hinzu. Hänge die Perlen wieder auf.
Legen Sie das Röhrchen für drei Minuten wieder auf den Magneten und entfernen Sie den Überstand. Für die erste Aufreinigungsrunde wird Lysepuffer in das RNA-Probenröhrchen gegeben und gründlich gemischt. Anschließend wird die Mischung in die Oligo(dT)-Kügelchen überführt und mindestens 10 Mal vollständig pipettiert.
Lassen Sie die Proben mit kontinuierlicher Rotation bei Raumtemperatur inkubieren. Nach 15 Minuten wird die Probe fünf Minuten lang auf einen Magneten gelegt oder bis der Überstand klar ist. Verwerfen Sie den Überstand.
Geben Sie 600 Mikroliter Waschpuffer eins zu den Perlen und mischen Sie sie vorsichtig, um sie zu resuspendieren. Als nächstes 300 Mikroliter Waschpuffer zwei zu den Perlen geben und vorsichtig mischen, um sie zu resuspendieren. Legen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang auf den Magneten oder bis der Überstand frei ist.
Verwerfen Sie den Überstand. Als nächstes werden 30 Mikroliter kaltes 10 Millimolar Tris HCL in das Probenröhrchen gegeben und bei 70 Grad Celsius inkubiert. Nach fünf Minuten setzen Sie das Röhrchen schnell auf den Magneten.
Und wenn die Suspension klar ist, wird der Überstand, der die eluierte Poly(A)angereicherte RNA enthält, in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Für die zweite Reinigungsrunde werden 120 Mikroliter Lysepuffer in die eluierte RNA-Probe gegeben und gründlich gemischt. Waschen Sie die in der ersten Reinigungsrunde verwendeten Kügelchen mit einem gleichen Volumen Lysepuffer.
Pipettieren Sie 10 Mal, um die Kügelchen wieder zu suspendieren, und legen Sie dann das Röhrchen fünf Minuten lang auf den Magneten, bevor Sie den Überstand entsorgen. Die RNA-Lysepuffermischung wird auf die gewaschenen Kügelchen übertragen und durch Pipettieren gründlich vermischt. Nachdem Sie die Kügelchen wie zuvor gezeigt gewaschen haben, geben Sie 25 Mikroliter kaltes 10 Millimolar Tris HCL in das Probenröhrchen und inkubieren Sie bei 70 Grad Celsius.
Nach fünf Minuten wird das Röhrchen schnell in den Magneten überführt, und wenn die Suspension klar ist, wird der Überstand mit eluierter poly(a)angereicherter RNA in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Als nächstes werden für die Bisulfit-Umwandlung 19 Mikroliter der gereinigten Poly(A)-angereicherten RNA-Probe in ein 0,2-Milliliter-Röhrchen mit acht Streifen überführt und ein Mikroliter Spiking-Kontrolle im vorgegebenen Mengenverhältnis von eins zu 10.000 hinzugefügt. Nachdem Sie 130 Mikroliter Umwandlungsreagenz in die Röhrchen gegeben und gründlich gemischt haben, legen Sie das Röhrchen in das PCR-Gerät und starten Sie das PCR-Programm.
Platzieren Sie die Säule nach der PCR auf dem Sammelröhrchen und fügen Sie der Säule 250 Mikroliter RNA-Bindungspuffer hinzu. Anschließend werden 150 Mikroliter der mit Bisulfit behandelten Probe in die Säule überführt und gründlich pipettiert. Geben Sie 400 Mikroliter 95 bis 100 % Ethanol in die Säule, schließen Sie die Kappe schnell und drehen Sie sie mehrmals um.
Nach wiederholtem Zentrifugieren, Waschen und Neutralisieren mit Desulfonierungspuffer wird die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Geben Sie 20 bis 30 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die Säule und lassen Sie sie eine Minute stehen. Zentrifugieren Sie bei 10.000 G für 30 Sekunden bei 25 Grad Celsius und übertragen Sie 2,2 Mikroliter Überstand in acht Streifenröhrchen, um die RNA-Quantität und -Qualität zu beurteilen.
Die Effizienz der Poly(A)RNA-Anreicherung wurde mittels Kapillarelektrophorese-Gesamt-RNA-Assay untersucht, was zu einer verringerten ribosomalen RNA-Kontamination nach doppelter Reinigung in Pankreaskarzinomzelllinien führte. Die RNA-Menge vor und nach der Bisulfit-Behandlung wurde mittels Kapillarelektrophorese bestimmt. Nach der Bisulfit-Behandlung zeigte die RNA-Größenverteilung aufgrund der durch die Bisulfit-Reaktion verursachten Fragmentierung einen Nukleotid-Peak von 200 bis 500 Nukleotiden.
Die Kapillarelektrophorese des Amplikons zeigte eine erfolgreiche Bibliothekspräparation mit minimalem Restprimer und ohne Überamplifikationspeak. Nachdem die sequenzierenden Reads auf die Referenzsequenz ausgerichtet waren, wurde der Durchschnitt von 2.440 der gesamten Reads auf die Spiking-Sequenz abgebildet, und die gesamte analysierte C-zu-T-Konvertierungsrate erreichte einen Durchschnitt von 99,81 %
