Entfernen Sie zunächst die obere und untere Kappe von der Spin-Säule des kommerziellen Proteinanreicherungskits und bewahren Sie diese für die zukünftige Verwendung auf. Stellen Sie die unverschlossene Spin-Säule in ein zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Aufbau bei 1000 g und Raumtemperatur für 30 bis 60 Sekunden, um die Lagerlösung zu entfernen und zu entsorgen.
Geben Sie 200 Mikroliter Waschpuffer zu den Anreicherungsperlen in der Schleudersäule und mischen Sie sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Nachdem Sie die Schleudersäule wie zuvor gezeigt zentrifugiert haben, verwerfen Sie den gesammelten Puffer. Setzen Sie die untere Kappe wieder auf und geben Sie 200 Mikroliter Wasser in die Schleudersäule, bevor Sie die obere Kappe wieder aufsetzen.
Mischen Sie die vorbereitete wässrige Kügelchenaufschlämmung, indem Sie sie auf und ab pipettieren, bevor Sie 40 Mikroliter davon in die vorbereitete Probe des monoklonalen Antikörper-Arzneimittels überführen. Inkubieren Sie das Röhrchen, indem Sie es zwei Stunden lang bei Raumtemperatur drehen. Als nächstes bohren Sie mit einer 16-Gauge-Nadel Löcher in eine Fritte geeigneter Größe und führen sie in das Spitzenende einer 200-Mikroliter-Spitze ein.
Übertragen Sie die Probe mit den Kügelchen auf die vorbereitete Spitze und geben Sie sie in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Loch in der oberen Kappe. Zentrifugieren Sie die Spitze im Röhrchen, um die Lösung zu entfernen. Waschen Sie die Perlen, indem Sie 200 Mikroliter Waschpuffer in die Spitze geben.
Entfernen Sie den Waschpuffer, indem Sie die Spitze in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugieren. Als nächstes waschen Sie die Perlen in der Spitze mit 200 Mikrolitern Wasser und zentrifugieren Sie sie wie zuvor gezeigt, um das Wasser zu entfernen. Geben Sie nun 10 Mikroliter Elutionspuffer in die Spitze und tränken Sie die Kügelchen gründlich darin, indem Sie die Aufschlämmung 10 Mal auf und ab pipettieren.
Führen Sie die Spitze in ein neues 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Loch in der oberen Kappe und zentrifugieren Sie das Röhrchen, um das entwichene Protein aufzufangen. Geben Sie 1,5 Mikroliter Trypsinlösung in den Eluenten und lassen Sie ihn über Nacht bei 28 Grad verdauen. Geben Sie dann 1,5 Mikroliter von 25 Milligramm pro Milliliter Dithiothreitol in die Probe und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei 90 Grad.
Anschließend wird die Probe mit 1,5 Mikrolitern 0,25 molar Iodacetamid bei Raumtemperatur im Dunkeln für 20 Minuten inkubiert. Danach werden 3,5 Mikroliter 10%ige Trichloressigsäure oder TFA zugegeben und die Probe zwei Minuten lang aufgewirbelt. Die Probe wird bei 14.400 g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert, um SDC und SLS auszufällen.
Sammeln Sie den angesäuerten Überstand zum Entsalzen. Geben Sie 50 Mikroliter Puffer B in die GC-Entsalzungsspitze. Legen Sie dann die Spitze in eine Halterung und zentrifugieren Sie sie bei 1000 G für drei Minuten bei Raumtemperatur.
Geben Sie 50 Mikroliter Puffer A in die Spitze und drehen Sie die Spitze wie zuvor gezeigt. Geben Sie nun die angesäuerte Probe in die Spitze. Zentrifugieren Sie die Spitze im Halter bei 500 G sechs Minuten lang bei Raumtemperatur.
Anschließend wird die Spitze gewaschen, indem Sie 50 Mikroliter Puffer A hinzufügen und bei 500 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur schleudern. Eluieren Sie das Peptid aus der GC-Entsalzungsspitze, indem Sie 50 Mikroliter Puffer B hinzufügen und die Spitze in einem neuen Röhrchen bei 500 G drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren. Danach wird der gesammelte Eluent mit einem Vakuumkonzentrator getrocknet.
Der getrocknete Eluent wird in 30 Mikrolitern 0,1%iger Ameisensäurelösung erneut suspendiert. Messen Sie die ultraviolette Absorption der Peptidmischungen bei 214 Nanometern mit einem Spektralphotometer. Zum Schluss werden 10 Mikroliter der aufgeschlossenen Probe in ein Flüssigchromatographie-Probenfläschchen überführt und ein Mikrogramm der Probe mittels Nano-LC-MS/MS analysiert.
Die Gesamtionenchromatogrammprofile der Wirtszellproteine zeigten, dass im Vergleich zur direkten Verdauung die meisten der wichtigsten monoklonalen Antikörperpeptide nach der nachgewiesenen Proteinanreicherung in Verbindung mit einem begrenzten Verdauungsprotokoll entweder reduziert oder eliminiert wurden.
