Um intrazelluläre Metaboliten aus lyophilisiertem Holobiont zu extrahieren, fügen Sie dem lyophilisierten Holobiont 400 Mikroliter 100% kaltes Methanol mit internen Standards hinzu. Fügen Sie dann 10 Milligramm säuregewaschene Glasperlen hinzu und legen Sie das Röhrchen in eine vorgekühlte Perlenmühle. Bei 50 Hertz für drei Minuten einführen.
Nach der Lyse 600 Mikroliter kaltes Methanol und Wirbel für eine Minute hinzufügen. Legen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einen Drehspießschüttler. Um Metaboliten aus getrennten lyophilisierten Symbiodiniacae-Zellen zu extrahieren, fügen Sie 200 Mikroliter kaltes Methanol mit internen Standards zu den getrockneten Symbiodiniacae-Zellen hinzu.
Dann fügen Sie säuregewaschene Glasperlen hinzu und legen Sie das Rohr in einen vorgekühlten Perlmühleneinsatz mit 50 Hertz. Nach drei Minuten 800 Mikroliter Methanol zugeben und 30 Sekunden lang vortexen. Für die Metabolitenextraktion aus abgetrenntem lyophilisiertem Wirtsgewebe wird ein Milliliter kaltes Methanol mit internen Standards in das getrocknete Wirtsmaterial gegeben und 20 Sekunden lang vorgewirbelt.
Legen Sie dann das Röhrchen in einen schwimmenden Röhrchenhalter für die Beschallung bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Als nächstes zentrifugieren Sie für die Reinigung des Metabolitenextrakts alle Proben bei 3000 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Den Überstand vorsichtig in ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, ohne das Pellet zu stören.
Suspendieren Sie das Pellet erneut in einem Milliliter 50%igem kaltem Methanol und wirbeln Sie es eine Minute lang kräftig vor. Erneut zentrifugieren, dann den Überstand der polaren Extrakte sammeln und mit den halbpolaren Extrakten aus derselben Probe zusammenführen. Zentrifugieren Sie die gepoolten Extrakte bei 16, 100 G für 15 Minuten, um Ausfällungen zu entfernen.
Für die Analyse werden 50 Mikroliter jedes Extrakts in einen Glaseinsatz aliquotiert und mit einem Vakuumkonzentrator 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius konzentriert. Die GCMS-Analyse ergab 107 annotierte Metaboliten über alle Behandlungen hinweg, darunter eine Reihe von Aminosäuren, organischen Säuren, Kohlenhydraten, Fettsäuren und sterilen Metaboliten. K bedeutet, dass drei verschiedene Cluster von Proben identifiziert wurden.
Die holobionten Proben waren ein Zwischenprodukt zwischen den getrennten Wirts- und Symbiontenfraktionen. Obwohl K Clusterverteilungen, parallele Koordinaten und die Visualisierung von Heatmaps in der Metaboliten-relativen Häufigkeit darauf hindeuteten, dass das Holobiontenprofil näher mit dem Wirtsfraktionsprofil übereinstimmte, unterschied sich signifikant sowohl vom Wirts- als auch vom Symbiontenprofil. Die Wirts- und Symbiontenprofile unterschieden sich signifikant voneinander mit 100 einzelnen Metaboliten, wobei sich die Wirts- und Symbiontenfraktionen signifikant unterschieden.
