Beginnen Sie damit, die mit Antikörpern markierten Drosophila-Larvenkadaver in 0,2 % PBST auf einen Objektträger zu legen. Unter dem Stereomikroskop eingestellt, wobei sichergestellt wird, dass die Innenfläche des Larvenkadavers nach oben zeigt. Nehmen Sie die überschüssige PBST-Lösung mit einem Tuch auf.
Geben Sie dann vorsichtig einen Tropfen Anti-Fade-Eindeckmedium hinzu. Legen Sie dann ein Deckglas auf den Objektträger, der die präparierten Larven langsam und vorsichtig bedeckt, um Blasenbildung zu vermeiden. Befestigen Sie das Deckglas, indem Sie Fingernagellack an den Rändern auftragen.
Bewahren Sie den Objektträger an einem dunklen Ort auf, um die Fluoreszenzdämpfung zu minimieren. Verwenden Sie für die Bildaufnahme das konfokale Laserscanning-Mikroskop mit dem 63x Ölimmersionsobjektiv. Passen Sie dann die Wellenlänge und die Laserleistung so an, dass sie den Anforderungen des Experiments am besten entsprechen.
Um die neuromuskulären Verbindungen zu identifizieren und Bilder von Muskel vier in Segment A drei aufzunehmen, wählen Sie einen 488-Nanometer-Laser, um Alpha-Tubulin oder Futsch zu aktivieren, und 546 Nanometer, um die HRP-Bildgebungsspur zu aktivieren. Ändern Sie die Parameter, um eine Bildgröße von 1.024 x 1.024 Pixeln, einen Digitalzoom von 1,0 und ein Bildintervall von 0,8 Mikrometern zu erreichen. Um Mikrotubuli im Muskel sichtbar zu machen, nehmen Sie Bilder von Muskel zwei in den Segmenten A drei bis A fünf auf, da er weniger Trachealäste hat.
Wählen Sie einen 488-Nanometer-Laser zur Aktivierung von Alpha-Tubulin und einen 633-Nanometer-Laser zur Aktivierung der T3605-Bildgebungsspur. Stellen Sie die Bildparameter auf eine Bildgröße von 1.024 x 1.024 Pixeln, einen Digitalzoom von 2,0 und ein Bildintervall von 0,4 Mikrometern ein. Sowohl prä- als auch postsynaptische Mikrotubuli-Organisationen des neuromuskulären Übergangs wurden mit Anti-Alpha-Tubulin markiert.
Die Futsch-Färbung spiegelte die Häufigkeit stabiler Mikrotubuli in den präsynaptischen Neuronen wider. Eine verminderte Signalintensität von Anti-Futsch wurde beobachtet, wenn Mikrotubuli, die das Protein Katanin 60 durchtrennten, in den präsynaptischen Neuronen überexprimiert wurde. Die Färbeintensität des Axonstamms war stärker als die der Äste.
Katanin-60-Mutationen führten zu vermehrten Mikrotubuli-Schleifen. Die Überexpression von Katanin 60 verursachte kurze Mikrotubuli-Fragmente in den terminalen Tasten. Die Alpha-Tubulin-Färbung zeigte ein klares Netzwerk von Mikrotubuli um den Zellkern.
Die Muskelzellen wiesen in der Katanin-60-Mutante eine signifikant erhöhte perinukleäre mikrotubuläre Intensität auf und wiesen stärkere Bündel auf. Die Überexpression führte zu einer Fragmentierung der Mikrotubulifasern.
