Beginnen Sie damit, eine einzelne Bakterienkolonie in 200 Milliliter sterilisierte Luria-Bouillon in einem 500-Milliliter-Erlenmeyerkolben zu impfen. Kultivieren Sie die Bakterien über Nacht in einem bei 37 Grad eingestellten Shaker-Inkubator. Überprüfen Sie nach 14 Stunden Kultur die optische Dichte der Bakterien bei 600 Nanometern.
Aliquotieren Sie die Bakterien in konische 50-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie sie zur weiteren Verwendung bei vier Grad Celsius. Mit einer serologischen Pipette werden 50 Milliliter der Bakterienkultur in einen neuen 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben überführt. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um 50 Milliliter der Bakterien in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen, um die simulierte Kontrolle vor dem Waschen durchzuführen.
Geben Sie in der Chemikalienhaube 781 Mikroliter Paraformaldehyd in die Bakterienkultur, um eine Endkonzentration von 0,5 % zu erreichen. Entsorgen Sie die gebrauchte Spitze in einem Behälter für chemische Gefahren aus festen Abfällen. Decken Sie den Kolben anschließend mit einem Blatt Folie ab und legen Sie ihn für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einen Schüttel-Inkubator. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, waschen Sie die Bakterien, um alle Paraformaldehyd-Reste zu entfernen.
Zur Entfernung des Restparaformaldehyds werden die behandelten Bakterien mit einer serologischen Pipette aus dem Erlenmeyerkolben in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Anschließend zentrifugieren Sie die behandelten Bakterien bei ca. 3000 g für 20 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand in einem Behälter für flüssige chemische Abfälle in der Chemikalienhaube.
Geben Sie nun 25 Milliliter der Luria-Brühe in die behandelten und kontrollierenden Bakterienpellets und wirbeln Sie die Bakterienpellets auf. Wiederholen Sie die Zentrifugation und die Resuspension der Pellets viermal. Zur Vorbereitung auf verschiedene Assays wird das Pellet in geeigneten Volumina resuspendiert.
Für Lifespan-Assays. Säen Sie 200 Mikroliter Bakterien, die in 10 Millilitern Luria-Brühe resuspendiert wurden, auf 60-Millimeter-Platten. Lagern Sie die Bakterien bei vier Grad Celsius.
Um eine Qualitätskontrolle des Bakterienwachstums durchzuführen, streichen Sie eine Luria-Bouillonplatte mit einem vorbereiteten Bakterium mit einer sterilen Pipettenspitze ab. Um die Kontamination zu überprüfen, steak Sie die Luria-Brühe, die zum Waschen und Resuspendieren verwendet wurde, auf einem separaten Teller. Als nächstes legen Sie die Platten über Nacht in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator.
Prüfen Sie am nächsten Tag auf Bakterienwachstum. Bewahren Sie die Bakterien auf, wenn die Paraform-Aldehyd-Präparation erfolgreich ist und die Kolonien auf der LB-Platte nicht wachsen. Um die bakterielle Stoffwechselaktivität mit einem Respirometer zu überprüfen, hydratisieren Sie zunächst die Kartusche, indem Sie 200 Mikroliter Kalibrant in alle Vertiefungen auf einer 96-Well-Platte geben.
Legen Sie die Kartusche in die 96-Well-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie das Gerät auf Mischen, Wiegen, Messen und Schleifen ein. Legen Sie am nächsten Tag die hydratisierte Kartusche in die Maschine.
Zu einer neuen 96-Well-Platte geben Sie 160 Mikroliter M9 in die Testvertiefungen, gefolgt von 40 Mikrolitern vorbereiteter Bakterien. Geben Sie 200 Mikroliter M9 in die vier Eckvertiefungen, um als Leerlöcher zu fungieren. Geben Sie 160 Mikroliter M9 und 40 Mikroliter Luria-Brühe als Negativkontrollen ab.
Zum Schluss pipettieren Sie 200 Mikroliter M9 in die verbleibenden unbenutzten Vertiefungen. Ersetzen Sie dann die ausgeworfene Kalibrierplatte durch die Assay-Platte, bevor Sie das Programm ausführen. Die Ergebnisse werden als Sauerstoffverbrauch angezeigt.
Verschiedene Stämme zeigten unterschiedliche Inaktivierungsreaktionszeiten auf Paraformaldehyd. Zum Beispiel reicht eine einstündige Exposition von HB101-Bakterien gegenüber 0,25 % aus, um sie metabolisch inaktiv zu machen. Enterococcus faecalis benötigte eine Konzentration von 1,0 % für eine konsistente Wirkung.
Caenorhabditis elegans-Würmer zeigten ähnliche Präferenzen gegenüber den behandelten OP 50-Stämmen wie auch gegenüber der simulierten Kontrolle. Ein sensitiver paarweiser Assay zeigte jedoch eine stärkere Präferenz für die simulierte Kontrolle. Würmer auf behandeltem OP 50 haben eine höhere Pumprate als Würmer auf der simulierten Kontrolle.
Der Verzehr von behandelten Bakterien führte zu einer verzögerten Entwicklungszeit bei Wildtyp-Würmern sowie zu einer verminderten Eiablagekapazität. Die Lebensdauer der Würmer unterschied sich nicht signifikant voneinander, unabhängig von der Nahrungsquelle. Die mit Paraformaldehyd behandelten Bakterien verlängerten jedoch die Lebensdauer der Würmer in Gegenwart von 5-Fluor-2'desoxyuridin. Der Verzehr der mit Paraformaldehyd behandelten Bakterien durch einen langlebigen Wurmstamm veränderte ihre Langlebigkeit nicht.
