Nehmen Sie zunächst einen Milliliter einer Knospenpilzzellkultur in der mittleren logarithmischen Phase, die auf die Mitochondrien abzielendes HyPer7 exprimiert. Zentrifugieren Sie die Zellen 30 Sekunden lang bei 6.000 G und entfernen Sie den Überstand, wobei 10 bis 20 Mikroliter im Röhrchen verbleiben. Resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie es vorsichtig mit einer Mikropipette mit Restmedien mischen.
Verwenden Sie als Nächstes ein Luftgebläse oder ein fusselfreies Tuch, um einen Objektträger aus Glas zu reinigen, und geben Sie 1,8 Mikroliter der Zellsuspension auf den Objektträger. Zum Schluss bedecken Sie die Zellen mit dem Glasdeckglas Nummer 1,5, indem Sie es langsam schräg absenken, um das Eindringen von Blasen zu vermeiden. Legen Sie dann den Objektträger auf den Mikroskoptisch.
Um die Zellen abzubilden, stellen Sie die Aufnahmebedingungen so ein, dass ein detektierbares Signal und eine akzeptable Auflösung in jedem Fluoreszenzkanal gewährleistet sind. Verwenden Sie beispielsweise bei einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop mit einer sCMOS-Kamera 2x2-Binning, 20 bis 40 % Laserleistung und 200 bis 600 Millisekunden Belichtung. Untersuchen Sie als Nächstes das Histogramm des Bildes.
Stellen Sie in einem 12-Bit-Bild sicher, dass der gesamte Dynamikumfang der Pixelwerte mindestens mehrere hundert Graustufen ohne Sättigung beträgt. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Reichweite um eine Größenordnung höher ist als der Geräuschpegel. Um den Rauschpegel zu berechnen, messen Sie die Standardabweichung der Pixelwerte in einem zellenfreien Bereich eines Bildes.
Sammeln Sie dann Zeitrafferbilder ohne Verzögerung zwischen den Aufnahmen, um die Auswirkungen der Bildgebungsbedingungen auf die Signalstabilität und den oxidativen Stress in den Mitochondrien zu bewerten. Messen Sie mit der Mikroskop-Erfassungssoftware oder ImageJ den durchschnittlichen Pixelwert in jedem Fluoreszenzkanal, um die Signalstabilität zu gewährleisten. Wenn das Experiment keine Zeitraffer-Bildgebung beinhaltet, stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenz über zwei oder drei wiederholte Z-Stapel stabil ist.
Erfassen Sie Bilder mit einem Z-Intervall von 0,5 Mikrometern in einer Gesamtstapeltiefe von sechs Mikrometern für knospende Hefen. Stellen Sie beim Erfassen von Z-Stapeln sicher, dass das Z-Intervall für alle Bilder im Datensatz gleich ist und die gesamte Zelle einschließt. Erfassen Sie auch Durchlichtbilder, um Zellgrenzen zu dokumentieren.
