Öffnen Sie zunächst ein Mehrkanal-Z-Stapelbild in Fidschi und öffnen Sie die gewünschte Skriptdatei für die Biosensoranalyse. Klicken Sie im Skript-Editor-Fenster auf Ausführen, um das Skript auszuführen. Geben Sie dann die angeforderten Informationen in das angezeigte Dialogfenster ein.
Wählen Sie die Kanalnummern des Zählers und Nenners für die Verhältnisberechnung aus. Bei HyPer7, das auf Mitochondrien abzielt, ist der Zähler der Kanal, der bei 488 Nanometern angeregt wird, und der Nenner ist der Kanal, der bei 405 Nanometern angeregt wird. Wählen Sie die Kanalnummer des Durchlichtbildes, falls vorhanden, oder Null, wenn keines vorhanden ist.
Wählen Sie dann die gewünschte Subtraktionsmethode für den Hintergrund. Wenn der Hintergrund einheitlich ist, klicken Sie auf Bildbereich auswählen, um den Hintergrundpegel im Bild zu messen. Wählen Sie anschließend die gewünschte Rauschsubtraktionsmethode, um zufällige Schwankungen in der Detektoranzeige zu reduzieren.
Klicken Sie auf Bildbereich auswählen. Wählen Sie die Option Festwert, um einen zuvor gemessenen Rauschpegel einzugeben, was in der Regel gut funktioniert, wenn die Bildbedingungen konstant gehalten werden. Für eine genaue und konsistente Erkennung von Mitochondrien wählen Sie einen Schwellwertalgorithmus wie Otsu oder Maximale Entropie.
Verwenden Sie den gleichen Algorithmus für alle Bilder in einem Experiment, aber stellen Sie sicher, dass die Mitochondrien genau erkannt werden. Wählen Sie dann die Anzahl der Interessenbereiche pro Zelle aus. Wenn Sie z. B. die Unterschiede zwischen den Mutterknospen messen möchten, wählen Sie zwei aus.
Wählen Sie den Ausgabeordner aus, in dem Maße und Verhältnisbilder gespeichert werden sollen. Wählen Sie für die Hintergrund- oder Rauschkorrektur Bildbereich auswählen. Befolgen Sie die Anweisungen, um einen Hintergrundbereich mit dem Rechteck-ROI-Tool zu zeichnen, und klicken Sie auf OK.
Zeichnen Sie bei der Analyse einzelner Zellen oder subzellulärer Regionen die interessierenden Bereiche basierend auf dem Hellfeldbild. Der ROI muss nicht genau mit dem Zellumriss übereinstimmen, da nur Mitochondrien innerhalb des ROI gemessen werden. Nachdem Sie jede ROI erstellt haben, drücken Sie T, um die ausgewählte ROI zum ROI-Manager hinzuzufügen.
Aktivieren Sie Alle anzeigen im ROI-Manager, um die markierten Zellen zu dokumentieren. Jede hinzugefügte Region wird als nummeriertes Element in der ROI-Manager-Liste angezeigt. Wenn Sie mehr als eine ROI pro Zelle analysieren, markieren Sie die ROIs für jede analysierte Zelle in der gleichen Reihenfolge.
Nachdem alle gewünschten ROIs zum ROI-Manager hinzugefügt wurden, klicken Sie im Dialogfenster Zellen markieren auf OK. Wählen Sie als Nächstes das Format der Messtabelle aus. Aktivieren Sie im Dialogfenster "Multi Measure" die Optionen "Alle Slices messen" und "Eine Zeile pro Slice", um eine Tabelle mit dem gewünschten Format zu erstellen.
Verwenden Sie die Prozess-Multi-ROI-Tabellen. rscript, um die Tabellen zu verarbeiten, die mit der Option one-row-per-slice erstellt wurden. Aktivieren Sie nicht die Option append-results.
Speichern Sie die Ausgabedateien mithilfe des Skripts im ausgewählten Ordner. Öffnen Sie nun das Z-Stapelbild in Fidschi, um ein koloriertes Verhältnisbild zu erzeugen. Öffnen Sie dann die colorize_ratio_image.
ijm-Skriptdatei und klicken Sie im Skript-Editor-Fenster auf Ausführen. Es erscheint ein Dialogfenster, in dem Sie aufgefordert werden, die angeforderten Informationen einzugeben. Bei der unmodulierten Option erscheinen alle mitochondrialen Pixel mit der gleichen Helligkeit.
Einige Bilder können verrauscht erscheinen, da dunkle und helle Pixel zum Verhältnisbild beitragen. Verwenden Sie die intensitätsmodulierte Option, um das Rauschen zu reduzieren. Wählen Sie in der Methode "Minimale und maximal angezeigte Werte" Werte aus, die in der Nähe der durchschnittlichen Minimal- und Maximalwerte liegen, die in einem Experiment beobachtet wurden.
Um die Konsistenz zu gewährleisten, erfassen Sie alle Bilder mit denselben Bildbedingungen, und zeigen Sie alle Bilder mit denselben Minimal- und Maximalwerten an. Wählen Sie dann den Projektionsmodus, um den Z-Stapel zu projizieren und die gesamte mitochondriale Population vor der Färbung anzuzeigen. Für eine Projektion mit maximaler Intensität wählen Sie Maximum.
Um eine Projektion der durchschnittlichen Intensität zu erstellen, wählen Sie Durchschnitt aus. Wählen Sie abschließend den Ordner aus, in dem die kolorierten Bilder gespeichert werden sollen. Wenn die Option unmoduliert ausgewählt ist, wählen Sie im angezeigten Dialogfenster ein Farbschema aus.
Verwenden Sie die in Fiji integrierten Fire- oder Rainbow-RGB-Lookup-Tabellen oder jede gewünschte Lookup-Tabelle im LUT-Format von ImageJ. Verwenden Sie das Skript, um die Ausgabedateien im ausgewählten Ordner zu speichern. Das oxidierte reduzierte Verhältnis von Mitochondrien mit der Markierung HyPer7 zeigte eine dosisabhängige Reaktion auf die Wasserstoffperoxidkonzentration, die bei ein bis zwei Millimolar extern zugesetztem Wasserstoffperoxid ein Plateau erreichte.
Unterschiede im mitochondrialen Wasserstoffperoxid wurden innerhalb der Hefezellen beobachtet. Eine statistisch signifikante Abnahme der Wasserstoffperoxid-Biosensor-Auslesung wurde in den Mitochondrien in der Knospe im Vergleich zur Mutterzelle festgestellt.
