Bei einer lentiviralen Infektion werden die trypsinisierten MPNST-Zielzellen nach der Zählung plattiert, wobei 2,5 Millionen Zellen pro 15-Zentimeter-Schale erhalten bleiben. Die Zellen mit dem aufgetauten Virus werden bei einer Multiplizität von 0,5 in Gegenwart von fünf Mikrogramm pro Milliliter des kationischen Polymers transduziert. Trypsinisieren Sie die Zellen drei Tage nach der Zugabe von Puromycin.
Die Hälfte der Zellpopulation wird bei 200 G fünf Minuten lang in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Nachdem Sie die andere Hälfte der Zellpopulation neu plattiert haben, züchten Sie sie für etwa sieben Populationsverdopplungen, bevor Sie sie ernten und zentrifugieren, wie zuvor gezeigt. Teilen Sie das resuspendierte Zellpellet entsprechend der gewünschten Zeit in zwei 15-Milliliter-Polymethylpenten-Röhrchen auf.
Fügen Sie 500 Mikroliter 10%SDS pro Röhrchen hinzu. Mischen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Röhrchen in ein DNA-Schergerät, um die DNA zu beschallen.
Nach der Zugabe von Phenol und Chloroform. Gut mischen, indem man 45 bis 60 Sekunden lang bei maximal möglicher Geschwindigkeit kräftig wirbelt. Übertragen Sie drei Milliliter der resultierenden klaren oberen Phase aus jedem Röhrchen in ein anderes frisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Fügen Sie 0,5 Milliliter dreimolares Natriumacetat und vier Milliliter Isopropanol hinzu und mischen Sie es gut. Nachdem Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 7, 200 g und 20 Grad Celsius zentrifugiert und den Überstand verworfen haben, geben Sie 0,5 Milliliter 70%iges Ethanol in das Pellet und lösen es durch Pipettieren auf und ab. Mischen Sie die resuspendierten Pellets aus beiden Röhrchen zu einem 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen.
Führen Sie die PCR-Reaktionen unter den auf dem Bildschirm angezeigten Bedingungen durch. Nach der zweiten PCR-Reaktion werden die vier Proben in einem Mikrozentrifugenröhrchen zusammengefasst. Und fügen Sie 80 Mikroliter 6-fachen Ladefarbstoff hinzu.
Visualisieren Sie das Gel und bestätigen Sie eine Bande bei ca. 250 Basenpaaren. Humane MPNST-Zellen, die mit einer Non-Target-Kontrolle und Lentivirus transduziert wurden und vier verschiedene Bcl-6-Kurzhaarnadel-RNAs exprimierten, zeigten, dass mehrere der Bcl-6-Kurzhaarnadel-RNAs die Zellzahl deutlich reduzierten. Der Immunblot zeigte, dass der Grad der Abnahme der Zellzahl mit dem Grad des Bcl-6-Abbaus korrelierte.
