Bereiten Sie eine 12-Milliliter-Verdünnung von 60%igen und 70%igen Trennmedien in konischen 50-Milliliter-Röhrchen vor. Als nächstes bereiten Sie den Gradienten von unten nach oben vor, indem Sie mit einer Fünf-Milliliter-Pipette jeweils vier Milliliter der 60%igen Verdünnung über die 70%ige Verdünnung hinzufügen. Dann vorsichtig 12 Milliliter heparinisiertes Blut auf den Dichtegradienten geben und bei 200 g 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren.
Verwerfen Sie die Plasma- und mononukleären Zellschichten. Anschließend werden ca. 7,5 Milliliter der Schicht über dem Erythrozytenpellet vorsichtig in zwei konische 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g fünf Minuten lang bei 19 Grad Celsius.
Waschen Sie das Zellpellet mit Hanks'Balanced Salt Solution oder HBSS. Führen Sie dann eine hypotone Lyse durch und entfernen Sie die verbleibenden roten Blutkörperchen. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, werden die polymorphkernigen Neutrophilen vorsichtig in den verbleibenden Puffer resuspendiert und in ein eiskaltes Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Als nächstes werden drei Ein-Mikroliter-Aliquots der Zellsuspension auf einen sauberen Objektträger übertragen. Färbung mit schneller Panoptik, um die Zellmorphologie und -reinheit zu beurteilen. Beobachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop und zählen Sie 300 zufällige Zellen in jeder Vertiefung.
Markieren Sie die Neutrophilen und andere Zelltypen, um die Reinheit der Trennung zu beurteilen. Als nächstes wird ein Mikroliter der Zellsuspension in 49 Mikroliter 0,2%iger Trypanblaufarbstoff überführt und tote und lebensfähige Zellen mit einer Neubauer-Kammer gezählt. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 6.667 Zellen pro Mikroliter mit 50 % autologem Plasma und 50 % HBSS ein, ergänzt mit Kalzium und Magnesium.
Anschließend wird die Zellsuspension gleichmäßig auf 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen verteilt, die den Testbedingungen einschließlich der Negativkontrolle entsprechen. Bereiten Sie ein Aktivierungssystem für jede Erkrankung vor, um sicherzustellen, dass die endgültige Zellkonzentration bei 6.600 polymorphkernigen Neutrophilen pro Mikroliter bleibt. Bei 37 Grad Celsius ohne Rotation inkubieren.
