Beginnen Sie damit, 0,0005 Gramm NBT in 10 Mikrolitern DMSO aufzulösen. Nach 15 Minuten Vortexen 90 Mikroliter Hank's Balanced Salt Solution oder HBSS mit Calcium und Magnesium und einen Mikroliter der Testsubstanzen hinzufügen. Auch hier solltest du den Schlauch bis zu zwei Minuten lang vortexen.
Um den NBT-Objektträgertest durchzuführen, werden vorsichtig zwei Mikroliter der zuvor präparierten aktivierten polymorphkernigen Neutrophilen gemischt und auf einen sauberen Objektträger übertragen. Inkubieren Sie den Objektträger in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Als nächstes geben Sie einen Mikroliter der NBT-Arbeitslösung über die Zellen.
Erneut 20 Minuten inkubieren und vor Licht schützen. Nach dem Trocknen des Objektträgers fixieren Sie ihn, indem Sie eine Minute lang einen Tropfen Methanol in jede Vertiefung geben. Färben Sie den Objektträger eine weitere Minute lang mit 0,03 Safranin ein.
In jeder Vertiefung werden 100 zufällige Zellen gezählt, die Neutrophile mit und ohne Formazan-Ablagerungen differenzieren. Um den NBT-Spektrophotometrie-Assay durchzuführen, werden 90 Mikroliter der zuvor hergestellten aktivierten polymorphkernigen Neutrophilen vorsichtig gemischt und in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Dann vorsichtig 20 Mikroliter einer sechs Millimolaren NBT-Lösung zugeben und das Röhrchen 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.
Nach der Inkubation 100 Mikroliter 10 % SDS und Vortex hinzufügen. Beschallen Sie mit einer Spitze mit einer Amplitude von 60 % und fügen Sie fünf Zyklen von jeweils 15 Sekunden und 15-Sekunden-Intervalle hinzu. Bei 12.000 g fünf Minuten zentrifugieren.
Übertragen Sie 60 Mikroliter Überstand auf eine 96-Well-Platte mit klarem Boden und messen Sie die Absorption des Überstandprodukts bei 570 Nanometern. Die Ergebnisse des spektrophotometrischen Assays zeigten, dass 100 nanomolare PMA im Vergleich zu den fMLP- und Kontrollgruppen eine erhöhte ROS-Produktion induzierten. Die Ergebnisse des NBT-Objektträgertests bestätigten die spektrophotometrischen Ergebnisse und zeigten, dass PMA im Vergleich zu fMLP der intensivste ROS-Produktions-induzierende Stimulus ist.
