IPSC Differentiation into Posterior Primitive Streak and Nephrogenic Intermediate Mesoderm

Beginnen Sie mit dem Waschen der induzierten pluripotenten Stammzellen oder iPS-Zellen auf der mit Membranmatrix beschichteten 6-Well-Platte mit zwei Millilitern DPBS. Saugen Sie das DPBS mit einer Pipette an. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter der handelsüblichen Zellablösungslösung hinzu, um die iPS-Zellen abzulösen.

Dann wird die Zelle fünf Minuten lang bei 37 Grad in einen Inkubator gestellt. Pipettieren Sie nun einen Milliliter mTeSR auf die iPS-Zellen und stellen Sie sicher, dass sich die Zellen von der Kunststoffoberfläche getrennt haben. Zentrifugieren Sie diese Zellen bei 400 g für drei Minuten bei Raumtemperatur.

Resuspendieren Sie das Zellpellet und zählen Sie dann die Zellzahlen mit einem Hämozytometer. Als nächstes säen Sie eine Reihe von Zelldichten auf eine 6-Well-Platte, die mit einer Membranmatrix beschichtet wurde. Kultivieren Sie diese mit mTeSR, ergänzt mit 10 mikromolaren Rho-Kinase-Inhibitoren.

Kulturieren Sie die Platten über Nacht in einem Kohlendioxid-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Am nächsten Tag saugen Sie den mTeSR an und waschen die Zellen mit zwei Millilitern DPBS. Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter Medium der Stufe 1 zu den Zellen hinzu.

Dann legen Sie die Zellen für vier Tage in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Entfernen Sie am vierten Tag das Medium der Stufe 1 und waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern DPBS. Geben Sie dann zwei Milliliter Medium der Stufe 2 zu den Zellen, bevor Sie die Zellen wie zuvor inkubieren.

Vom ersten bis zum vierten Tag breiteten sich die iPS-Zellen schnell aus und nahmen rautenförmige oder dreieckige Formen an. Die Konfluenz erreichte 90 bis 100 % und akkumulierte sich gleichmäßig bis zum siebten Tag. Nach der Suspensionskultur bilden die Aggregate spontan Nephronstrukturen, nachdem sie am siebten Tag dissoziiert wurden.