Beginnen Sie mit der Entfernung des Mediums der Stufe II aus der iPSC-Zellsuspension am siebten Kulturtag. Waschen Sie nun die Zellen mit zwei Millilitern DPBS. Pipettieren Sie einen Milliliter Zellablösungslösung in jede Vertiefung.
Dann legen Sie die Platte für fünf Minuten bei 37 Grad in einen Inkubator. Nach der Inkubation geben Sie einen Milliliter Medium der Stufe II zu den Zellen und mischen Sie gründlich, bis sich die Zellen von der Oberfläche gelöst haben. Die Zellsuspension wird in einem 15-Milliliter-Röhrchen aufgefangen und dann bei 400 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Zellpellet in zwei Millilitern Medium der Stufe III resuspendiert. Mischen Sie die Lösung vorsichtig. Säen Sie nun die Suspension im Verhältnis eins zu drei in eine Platte mit sechs Vertiefungen und geringer Adhäsion.
Stellen Sie die Platte auf einen Orbitalschüttler in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid eingestellt ist. Um das Medium in der Suspensionskultur zu entfernen, schneiden Sie zunächst die Spitze einer Ein-Milliliter-Pipette mit einer aseptischen Schere ab. Rühren Sie dann vorsichtig die Sechs-Well-Platte, um die Organoide zu zentralisieren.
Als nächstes saugen Sie die Organoide mit den vorbereiteten Pipetten an und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen, lassen Sie sie fünf Minuten stehen. Saugen Sie den Überstand an und stellen Sie sicher, dass die Organoide am Boden des Röhrchens verbleiben. Dann pipettieren Sie das Medium der Stufe III in die Platte.
Pipettieren Sie die Mischung, um die Organoide zu resuspendieren. Die Organoide werden wieder in eine Sechs-Well-Platte mit geringer Haftung überführt. Schütteln Sie die Platte mit geringer Haftung im Inkubator mit 60 Umdrehungen pro Minute weiter.
Ersetzen Sie das Medium am 12. Tag durch ein Medium der Stufe IV. Die Nierenorganoide weisen röhrenförmige Strukturen auf und sind nach 18 Tagen Aggregation in Hellfeldbildern gut zu beobachten. CD31-Endothelzellen wurden induziert.
Dextran wurde in die proximalen Tubuli der Nierenorganoide eingebracht.
