Um mit der Vorbereitung der elektronenmikroskopischen Gitter für die zelluläre Kryotomographie zu beginnen, legen Sie das mit perforierter Kohlenstoffträgerfolie beladene Gitter mit der Kohlenstoffseite des Gitters nach oben in eine Glimmentladungsvorrichtung. Anschließend wird das Gitter 45 Sekunden lang bei 15 Milliampere unter einem atmosphärischen Druck von 0,39 Millibar entladen. Wenn Sie fertig sind, legen Sie das Gitter in einen sauberen Behälter, der mit Filterpapier ausgelegt ist.
Als nächstes überführen Sie das Gitter zusammen mit Fibronektin, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS, Platten und Pinzetten in eine Biosicherheitswerkbank. Gießen Sie mit einer Mikropipette zwei großzügige Punkte Rinderfibronektin auf eine sterile Oberfläche, z. B. einen Deckel einer Sechswellenplatte. Stellen Sie sicher, dass die Punkte groß genug sind, um das gesamte Raster zu umhüllen.
Besorgen Sie sich dann eine fünf mal 15 Pinzette und behandeln Sie beide Seiten des Gitters mit der Fibronektin-Adhärenzlösung. Nach der Behandlung mit Rinderfibronektin wird das Gitter klebrig. Berühren Sie vorsichtig die kohlenstofffreie Oberfläche des Gitters mit dem Boden einer leeren Vertiefung in einer Platte mit sechs Vertiefungen und lassen Sie die Pinzette los, um das Gitter an der neuen Oberfläche zu befestigen.
Als nächstes wird das Gitter 30 Minuten lang in der Fibronektin-Adhärenzlösung inkubiert. Um ein Austrocknen der Gitter zu verhindern, geben Sie alle 15 Minuten mit einer Mikropipette ein bis zwei Tropfen Haftlösung auf die Gitter. Entfernen Sie nach der Inkubation die überschüssige Adhärenzlösung mit einer Mikropipette.
Waschen Sie die Gitter, indem Sie mit der Mikropipette zwei- bis dreimal PBS-Tropfen direkt auf die Gitter geben. Sterilisieren Sie die Gitter unter UV-Licht in einer Biosicherheitswerkbank für eine Stunde. Positionieren Sie die Gitter so nah wie möglich an der UV-Strahlung, um eine maximale Sterilisation zu erzielen.
Verhindern Sie, dass die Gitter während der Sterilisation austrocknen, indem Sie alle 10 Minuten ein bis zwei Tropfen PBS auf das Gitter pipettieren.
