Zwei bis drei Wochen vor der Bildgebung werden die Viruspartikel, die den genetisch kodierten Kalziumindikator tragen, in den Glaskörper eines betäubten Rattenauges injiziert. Mittels Fundoskopie und OCT wird die Netzhautstruktur auf Nebenwirkungen der Kalziumindikatorinjektion untersucht. Zwei Wochen nach der Injektion zeigte die Ganglienzellschicht oder GCL eine Fluoreszenzemission.
Dann wird die Netzhautexzision der euthanasierten Ratte eingeleitet. Nehmen Sie die Augen, die AAV2-CAG-GCaMP5G exprimieren, und entfernen Sie das gesamte Gewebe, das den Augapfel umgibt, mit einer kleinen gebogenen Pinzette und einer feinen Federschere. Als nächstes nimmst du ein drei mal drei Zentimeter großes Stück Filterpapier.
Positionieren Sie es auf dem Deckel einer 3,5 Zentimeter langen Schale und tränken Sie das Filterpapier mit AIMS-Medium. Positionieren Sie den Augapfel so auf dem Papier, dass das vordere Augensegment zum Bediener hin ausgerichtet ist. Verwenden Sie eine gerade Pinzette, um den Augapfel in einem Winkel von etwa 45 Grad zur Oberfläche der Schale zu halten.
Verwenden Sie den Spalt zwischen der geraden Pinzette, um einen Schnitt mit einer Klinge zu führen. Tauchen Sie dann den Augapfel in AIMS-Medium ein. Verwenden Sie eine gerade Pinzette und eine feine Federschere, um das vordere und hintere Augensegment zu trennen.
Entfernen Sie die Linse vorsichtig mit zwei geraden Pinzetten und lösen Sie die Netzhaut von der Sklera. Mit einer feinen Federschere einen Schnitt in die Sklera in Richtung Sehnerv machen und so lange schneiden, bis die Netzhaut erfolgreich von der Augenmuschel getrennt wurde. Übertragen Sie das herausgeschnittene Stück der Netzhaut mit einer Kunststoffpipette mit abgeschnittener Spitze auf die Montagemembran.
Verwenden Sie dann eine gerade Pinzette, um die Netzhaut flach zu befestigen und sicherzustellen, dass die Ganglienzellschicht nach oben ausgerichtet ist. Verwenden Sie als Nächstes eine Kunststoffpipette mit einer 100-Mikroliter-Pipettenspitze, um das Medium zu entfernen und das Anhaften des Netzhautstücks an der porösen Membran zu erleichtern. Drehen Sie als Nächstes die Baugruppe auf das Mikroelektroden-Array oder MEA und positionieren Sie die GCL auf den Elektroden.
Anschließend füllen Sie das Probenbad mit sauerstoffhaltigem AIMS-Medium.
