Platzieren Sie die GCaMP 5G-pumpende Rattennetzhaut auf der MEA, wobei die GCL den Elektroden auf dem Mikroskoptisch zugewandt ist. Schließen Sie das Perfusionssystem an und stellen Sie die Parameter so ein, dass das Probenbad ständig mit dem sauerstoffhaltigen AMS-Medium durchblutet wird. Als nächstes untersuchen Sie die Netzhaut mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Leuchtstofflampe, einem FITC-Filter und einer CMOS-Kamera ausgestattet ist.
Suchen Sie nach einem Bereich, in dem stimulierende Elektroden und die Fluoreszenz von GCaMP-exprimierenden Zellen sichtbar sind. Konfigurieren Sie in der Software der Impulsgeneratorgeräte die elektrischen Stimulationsparameter wie Form, Amplitude, Dauer, Phasenverzögerung und Frequenz der Impulse für die Anwendung. Verbinden Sie die Kamera mit dem Ausgangs-Trigger-Signal mit dem Impulsgeber und stellen Sie den Aufnahmemodus der Kamerasoftware auf externen Start-Trigger.
Drücken Sie die Starttaste in der Kamerasoftware, so dass sie auf einen externen Auslöser wartet, um zu starten. Initiieren Sie den Bildaufnahmeprozess mit der Impulsgenerator-Software und speichern Sie die aufgenommenen Bilder, wobei Sie sicherstellen müssen, dass der Dateiname alle angewendeten elektrischen Stimulationsparameter enthält. Öffnen Sie nun Bild J und segmentieren Sie den Interessenbereich mit den Bereichsauswahlwerkzeugen, fügen Sie ihn dem ROI-Manager hinzu und speichern Sie ihn über das Menü des ROI-Managers als ZIP-Ordner.
Extrahieren Sie den mittleren Grauwert aus den Zellen-Somas, indem Sie zu Mehr navigieren und auf Multi-Measure klicken. Aktivieren Sie die Optionen Alle 600 Slices und eine Zeile pro Slice messen, um eine einzelne Tabelle zu erhalten, in der die Spalten den ROIs und die Zeilen den Zeitrahmen entsprechen. Extrahieren Sie dann den Schwerpunkt aus den ROIs mit dem Befehl measure.
Um den Photobleaching-Effekt zu korrigieren und den Hintergrund zu minimieren, wählen Sie vor jedem Burst etwa 15 bis 20 Frames aus den nicht stimulierenden Intervallen aus und passen Sie diese Frames an eine lineare Kurve an, um eine optimale Datenanalyse zu gewährleisten. Gezeigt werden die Kalziumspuren von Zellsomas bei fünf Impulsstößen alle 10 Sekunden während einer 60-sekündigen Bildaufnahme. Rahmen aus den nicht stimulierenden Perioden werden verwendet, um den Photobleaching-Effekt zu korrigieren.
Die Beziehung zwischen dem Strom, der zur Aktivierung der Zellen erforderlich ist, und dem Abstand von der stimulierenden Elektrode zeigte, dass Zellen, die sich näher an der stimulierenden Elektrode befanden, niedrigere Stromwerte benötigten, um eine Reaktion hervorzurufen.
