Setzen Sie zunächst die betäubte C57 Black/6 JRj-Maus ein. Rückenlage auf einem beheizten Operationstisch. Vergewissern Sie sich, dass keine Reflexreaktionen auf das Einklemmen der Zehen vorliegen.
Besprühen Sie die Maus mit 70%igem Ethanol, um zu verhindern, dass Haare an der Schere kleben. Machen Sie mit einer Schere einen Bauchschnitt an der Basis und schneiden Sie auf beiden Seiten nach oben bis zum Brustkorb, um die Bauchhöhle freizulegen. Verwende ein Wattestäbchen, um den Darm nach rechts zu bewegen und die Pfortader freizulegen.
Platzieren Sie mit einer gebogenen Pinzette zwei Ligaturen unter der Pfortader und binden Sie jede Ligatur locker ab. Als nächstes wird ein 0,7-Millimeter-Katheter in die Pfortader eingeführt. Wenn die Nadel perforiert ist, entfernen Sie die Nadel aus dem Katheter und führen Sie den Katheter durch die Vene, bis sich die Spitze des Katheters in der Nähe der Leber befindet.
Ziehen Sie dann die Ligaturen fest. Beobachte die Leber. Stellen Sie die Durchflussmenge der Rollenpumpe ein und befestigen Sie das Profusionsröhrchen.
Initiieren Sie die Vermehrung der Leber bei 37 Grad Celsius. Sobald die Leber blass wird, schneiden Sie den Brustkorb und das Zwerchfell mit einer Schere ab. Platzieren Sie dann mit einer feinen Pinzette eine Ligatur unter der suprahepatischen unteren Hohlvene.
Anschließend wird ein Katheter durch den rechten Vorhof des Herzens in die suprahepatische untere Hohlvene eingeführt. Wenn die Nadel perforiert ist, entfernen Sie die Nadel und führen Sie den Katheter durch die Vene näher an die Leber. Ziehen Sie dann die Ligatur fest.
Befestigen Sie einen Schlauch zum Auffangen des Perfusionsabflusses und sichern Sie alle Schläuche mit wasserdichtem Klebeband. Platzieren Sie mit einem Gefäßklemmadapter eine Gefäßklemme über der infrahepatischen Hohlvene unmittelbar über der rechten Nierenvene, um eine abgestorbene Mischung zu vermeiden. Als nächstes erhöhen Sie die Perfusionsflussrate auf 3,5 Milliliter pro Minute.
Starten Sie den Timer und die Druckaufzeichnung. Bedecken Sie die Leber mit einem sterilen, mit Kochsalzlösung angefeuchteten Tuch, gleichen Sie sie 30 Minuten lang aus und messen Sie das Abwasservolumen. Nach 30 Minuten Äquilibrierung wird das Experiment für die erste Baseline-Probenentnahme im Fraktionssammler gestartet.
Überwachen Sie die Blasenfalle regelmäßig und füllen Sie sie mit Perfusionspuffer auf, wenn sie fast leer ist. Eine Pufferprobe wird über einen Dreiwegehahn unmittelbar vor dem Eintritt in das Organ und aus dem in die untere Hohlvene eingeführten Sammelkatheter entnommen. Messen Sie mit einem Blutgasanalysator die entnommene Probe, um zu bestätigen, dass das Organ metabolisch aktiv ist.
Nach 15 Minuten Basisperfusion mit einer Spritzenpumpe ist die erste Stimulation zu starten, indem eine Testsubstanz durch einen Dreiwegehahn mit der gewünschten Durchflussrate infundiert wird. Sammeln Sie nach der Simulation 20 bis 30 Minuten lang Baseline-Proben, bevor Sie mit der zweiten Stimulation beginnen. Die Produktion von Harnstoff in der perfundierten Leber mit konstanten Ausgangsperioden vor jeder der beiden Stimulationsperioden deutete darauf hin, dass die Reaktion von Harnstoff auf zwei aufeinanderfolgende Stimulationen mit gemischten Aminosäuren konsistent ist.
Es wurde eine stetige basale Freisetzung von Glukose und nicht veresterten Fettsäuren beobachtet. Vor einem robusten Anstieg von Glukose und Nicht-ED-Fettsäuren während der Glukagon-Infusion. Der Mittelwert im basalen Zustand und während der Glukagon-Infusion deutet darauf hin, dass Glukagon schnell die hepatische Glykogenolyse und Lipolyse stimuliert.
Ohne gleichmäßige Basalperioden wird es jedoch unmöglich, eine Harnstoffreaktion von der nächsten zu unterscheiden.
