Nach dem Aufbau und der Ausrichtung des polarisationsempfindlichen Zwei-Photonen-Mikroskopsystems gemäß der angezeigten schematischen Darstellung wird die optische Ausrichtungsqualität mit einer isotropen Referenzprobe wie Fluorescein in einem amorphen Polymer getestet. Schalten Sie dazu den Anregungslaser ein und messen Sie die 360-Grad-Polarkurven der Referenzprobe für eine Null-Halbwellenplatte. Stellen Sie den Halbwellenplattenwinkel so ein, dass er der X- und Y-Achse der Probenebene entspricht, und prüfen Sie, ob beide Photodioden ähnliche Intensitäten von zwei photonenangeregten Emissionskomponenten aufweisen.
Um die Probe zu analysieren, montieren Sie den Objektträger mit dieser Sphärolithprobe auf dem piezoelektrischen Tisch und stellen Sie sicher, dass die Vorderseite des Objektträgers, der das Deckglas enthält, dem Tauchobjektiv mit hoher numerischer Apertur zugewandt ist. Befestigen Sie dann den Objektträger mit Klebeband. Richten Sie als Nächstes die X-, Y- und Z-Positionen mit den Mikroskopknöpfen ein und fokussieren Sie das Objektiv auf den Sphärulit in der Lösung.
Konzentrieren Sie sich speziell auf den zentralen Bereich der gesamten Struktur, da Sphärolithdurchmesser in der Regel im Bereich von zehn Mikrometern liegen. Zentrieren Sie dann diesen Sphärulit im Sichtfeld in der Mikroskopebene. Bestimmen Sie die Größe des XY-Scans, indem Sie die Anzahl der Piezotischschritte in X- und Y-Richtung anpassen, um die gesamte Fläche der Struktur abzudecken.
Passen Sie die Parameter des Piezotisches wie Scangeschwindigkeit, Schrittweite und Bereich an, um den Bereich des gesamten Sphäruliths abzudecken. Öffnen Sie den Verschluss, schalten Sie die Fotodioden ein und erfassen Sie die X- und Y-Emissionskomponenten der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzintensität für jeden einzelnen Schritt des ausgewählten Scanbereichs für den Anregungsstrahl, der entsprechend der X- und dann der Y-Achse polarisiert ist. Scannen Sie dann diese Sphärolithprobe, was zu einer mit zwei Photonen angeregten Fluoreszenz führt.
Um eine vollständige Polarisationsanalyse von der spezifischen Stelle der Probe aus durchzuführen, schalten Sie den Anregungsstrahl aus. Nehmen Sie bestimmte Koordinaten des Piezotisches, die der gewählten Stelle auf diesem Sphärulit entsprechen, an der die Informationen über die Ausrichtung der Moleküle mit einer Auflösung von Submikrometern benötigt werden. Stellen Sie den piezoelektrischen Tisch so ein, dass das Sichtfeld bei den angegebenen X- und Y-Koordinaten zentriert wird.
Schalten Sie nach dem Einschalten des Anregungsstrahls die 180-Grad-Drehung der Halbwellenplatte ein, um eine vollständige 360-Grad-Polarisationsanalyse der X- und Y-Emissionskomponenten der mit zwei Photonen angeregten Fluoreszenzemission durchzuführen. Das Bild des Insulinsphäruliths, das nach der Durchführung eines 2PFM-Rasterscans erhalten wurde, stimmte mit den für einen Sperulith berichteten überein. Die Position der Halbwellenplatte, die der Anregung der Probe entlang der X- und Y-Achse entspricht, wurde ebenfalls überprüft.
Die Polardiagramme änderten sich, während eine vollständige Polarisationsanalyse von verschiedenen ausgewählten Punkten durchgeführt wurde. Außerhalb des Sperulits sah der PLO-Graph wie eine Ansammlung von Artefakten und zufälligen Signalrauschspitzen aus. Korrekt gemessene Polygraphen von hochgeordneten Stellen entlang der X- und Y-Achse wiesen unterschiedliche Formen und Geometrien auf, abhängig von der lokalen Orientierung und Organisation der Fluorophore.
