Machen Sie zunächst mit einem Skalpell einen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie einer euthanasierten Maus vom Hinterhaupt bis zum Sakralbereich. Mit einem stereoskopischen Operationsmikroskop vorsichtig durch Schichten bis zur Lendenwirbelsäule sezieren. Identifiziere den letzten Rippenbogen.
Identifiziere den letzten Halswirbel und das Kreuzbein. Machen Sie dann einen Schnitt, um die Wirbelsäule zu trennen. Führen Sie mit einer Präparierzange eine dorsale Laminektomie des Wirbels durch, um das Rückenmark zu extrahieren.
Entfernen Sie die Nerven, die durch die Foramina austreten und das periphere Nervensystem bilden. Legen Sie nun das entnommene Rückenmark auf ein Präparierbrett. Schneide es mit einer Vannas-Schere in zwei Millimeter große Stücke.
Anschließend werden die Stücke in ein Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen mit flachem Boden überführt. Geben Sie einen Milliliter HBSS-LD-Arbeitslösung in das Mikroröhrchen. Die Mischung bei 37 Grad Celsius 25 Minuten lang inkubieren.
Achte darauf, die Mischung alle fünf Minuten kräftig zu wirbeln. Als nächstes passieren Sie den Inhalt jedes Aufschlusses durch ein 40-Mikrometer-Sieb. Dann fügen Sie sieben Milliliter HBSS mit 2% FBS hinzu, um die Verdauung zu neutralisieren und das verbleibende Gewebe zu zerkleinern.
Die Suspension wird in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt, bevor sie fünf Minuten lang bei 220 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert wird. Verwenden Sie nun eine Ein-Milliliter-Mikropipette, um den Überstand zu entsorgen. Anschließend wird das Pellet in zwei Millilitern HBSS-FBS in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen resuspendiert.
Geben Sie zwei Milliliter 90%iges isotonisches Dichtegradientenmedium in das Röhrchen und zentrifugieren Sie die Mischung bei 160 g für 25 Minuten bei 18 Grad Celsius. Zum Schluss wird die Interphase mit einer Transferpipette entnommen und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern PBS und zentrifugieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei 220 g bei fünf Grad Celsius, bevor Sie weitere Experimente durchführen.
Die Aufreinigung der extrahierten Mikrogliazellen ergab eine Zellausbeute von bis zu 99 %, was durch FACS-Färbung bestätigt wurde. Es wurden doppelt positive Zellen mit einer durchschnittlichen Größe von 10 Mikrometern beobachtet, die mit nicht-aktivierten Mikroglia übereinstimmen.
