Entnehmen Sie zunächst die vorbereiteten menschlichen Kotproben. Kühlzentrifuge auf 4 Grad Celsius abkühlen. Verwenden Sie PBS, um das Gewicht der Probenröhrchen auf 0,1 Gramm einzustellen, und zentrifugieren Sie sie bei 3.000 G für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Füllen Sie den Überstand mit einer Kunststoffpipette in zwei 50-Milliliter-Röhrchen um und lassen Sie 1 Milliliter zurück. Dann zentrifugieren Sie den Überstand bei 12.000 G für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand mit einer 20-Milliliter-Spritze an und entfernen Sie die Nadel von der Spritze.
Filtern Sie die Flüssigkeit durch 0,22-Mikrometer-Filter in 50-Milliliter-Röhrchen. Wischen Sie den Eimer anschließend mit 75%igem Alkohol ab, um verbleibende Verunreinigungen zu entfernen. Etwa 30 Milliliter des gefilterten Stuhlüberstandes in das Ultrazentrifugenröhrchen überführen.
Füllen Sie das Röhrchen mit ca. 8 Millilitern PBS und lassen Sie einen Abstand von 3 Millimetern zur Öffnung des Röhrchens. Platzieren Sie die beiden Ultrazentrifugenröhrchen in gegenüberliegenden Ultrazentrifugationsbechern und gleichen Sie das Gewicht der beiden Eimer mit PBS aus. Laden Sie alle Schaufeln auf den Rotor, unabhängig davon, ob sie mit Rohren beladen sind.
Geben Sie die Proben in die Zentrifuge, starten Sie das Vakuum und schleudern Sie sie bei 160.000 G für 70 Minuten bei 4 Grad Celsius. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, lassen Sie das Kammervakuum los und öffnen Sie die Tür der Ultrazentrifuge. Entfernen Sie dann umgehend den Rotor.
Füllen Sie die Eimer vom Rotor in das Gestell und nehmen Sie die Röhrchen mit einer Zange auf. Werfen Sie den Überstand weg und bewahren Sie die sichtbaren braunen Pellets auf. Fügen Sie 1 Milliliter vorgekühltes PBS hinzu, um die Pellets vollständig zu resuspendieren.
Füllen Sie das Röhrchen mit ca. 37 Millilitern PBS und lassen Sie einen Abstand von 3 Millimetern zur Öffnung. Nachdem Sie eine weitere Runde der Ultrazentrifugation durchgeführt haben, verwerfen Sie den Überstand und lassen Sie das Röhrchen 5 Minuten lang umgedreht. Entfernen Sie die Reste der Lösung an der Innenwand mit Wischtüchern.
Geben Sie mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette 1,2 Milliliter vorgekühltes PBS hinzu, um die Pellets zu resuspendieren, und mischen Sie sie durch Pipettieren. Übertragen Sie 1,2 Milliliter der PBS BEV-Lösung aus einem Ultrazentrifugenröhrchen in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen.
