Nehmen Sie zunächst 500 Mikroliter der vorbereiteten PBS/BEV-Lösung ein. Kombinieren Sie es mit drei Millilitern PBS und mischen Sie es vorsichtig mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette. Stellen Sie ein 31-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen auf eine Schaumstoffplatte mit Löchern und beschriften Sie das Röhrchen mit einem Pfeil nach unten.
Halten Sie dann eine 1.000-Mikroliter-Pipette senkrecht und geben Sie drei Milliliter der 50%igen Iodixanol-Lösung auf den Boden des Röhrchens. Platzieren Sie einen Röhrchenhalter etwas oberhalb der Höhe der Schaumstoffplatte unter der Röhrchenöffnung und neigen Sie das Röhrchen in einem Winkel von 70 Grad. Geben Sie mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette drei Milliliter 40%ige Iodixanollösung auf die 50%ige Iodixanol-Lösung.
Dann drei Milliliter 20%ige Iodixanollösung auf die 40%ige Iodixanollösung schichten. Mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette drei Milliliter einer 10%igen Iodixanol-Lösung auf die vorbereitete 20%ige Iodixanol-Lösung geben. Als nächstes fügen Sie 3,5 Milliliter der PBS/BEV-Lösung auf die 10%ige Iodixanol-Lösung hinzu und bringen Sie die Röhrchen vorsichtig wieder in eine aufrechte Position.
Positionieren Sie nun ein 31-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen auf einer Schaumstoffplatte mit Löchern und beschriften Sie es mit einem Pfeil nach oben. Geben Sie mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette 2,5 Milliliter der 60%igen Iodixanol-Stammlösung vertikal in den Boden des Röhrchens und kombinieren Sie sie mit 500 Mikrolitern PBS/BEV-Lösung, um drei Milliliter 50%ige Iodixanol-BEV-Lösung zu erhalten. Mischen Sie die Lösung gründlich durch Pipettieren.
Nachdem Sie nacheinander 40, 20 und 10 % Iodixanol-Lösung aufgetragen haben, verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um 3,5 Milliliter PBS auf die 10%ige Iodixanol-Lösung zu geben. Stellen Sie das Gewicht der beiden Röhrchen mit PBS auf ein Gesamtgewicht innerhalb von plus minus 0,005 Gramm ein. Als nächstes positionieren Sie die Röhrchen in den Eimern und zentrifugieren sie bei 160.000 G sieben Stunden lang bei vier Grad Celsius.
Mit einer Pipette werden die Fraktionen, die aus einem Gradienten-Ultrazentrifugationsmodus gewonnen werden, nacheinander von oben nach unten an der Seitenwand in 10 separate 38,5-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen gesammelt. Anschließend werden die Fraktionen bei 160.000 G für 70 Minuten bei vier Grad Celsius ultrazentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und drehen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen fünf Minuten lang um.
Als nächstes werden die Pellets mit einer 200-Mikroliter-Pipette in 200 Mikroliter vorgekühltem PBS resuspendiert. Die PBS/BEV-Lösung wird in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen überführt. Markieren Sie die Fraktionen von F1 bis F10 so, wie sie aus einem Gradienten-Ultrazentrifugationsmodus erhalten wurden, und fahren Sie mit der Analyse fort.
