Besprühen Sie die euthanasierte Maus zunächst mit 75%igem Alkohol. Dann sterilisiert man eine Präparierschere, um die Haut zu öffnen und die Brusthöhle freizulegen. Schneiden Sie das Zwerchfell durch, schneiden Sie dann weiter nach oben in Richtung Unterkiefer und entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Bindegewebe und Fett, das die Halsschlagader freilegt.
Als nächstes durchtrennen Sie die untere Hohlvene, damit das Blut aus dem geschlossenen Kreislauf fließt. Mit einer Spritze langsam 20 Milliliter vorgekühlte Perfusionslösung in die linke Herzkammer injizieren. Halten Sie die Maus unter ein stereoskopisches Mikroskop.
Ziehen Sie dann mit einer Mikropräparierschere das Fett und das Bindegewebe um die Halsschlagader herum ab. Isolieren Sie die Halsschlagader und waschen Sie sie mit PBS, um das Restblut wegzuspülen. Übertragen Sie die Arterie auf eine Sechs-Well-Platte, die 1,5 % FBS auf Eis enthält.
Sezieren Sie die Halsschlagader mit einer Mikropräparierschere in Längsrichtung und legen Sie sie flach in eine neue Sechs-Well-Platte, die einen Milliliter FBS auf Eis enthält. Spülen Sie die Intima der Arterie vorsichtig mit FBS, um das Restblut zu entfernen. Schneiden Sie die Arterie in zwei Millimeter quadratische Gewebestücke und führen Sie diese in ein 1,5 Milliliter großes Zentrifugenröhrchen.
Bei 400 g 5 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren, um das Gewebe auf den Boden zu senken. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Gewebe erneut in 500 Mikroliter Dissoziationsreagenz A.Legen Sie das Röhrchen für eine Stunde in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad und pipettieren Sie vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette alle 10 Minuten. Dann 500 Mikroliter 5%FBS in das Röhrchen geben und gut vermischen.
Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein steriles 40-Mikron-Zellsieb in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie dann das Filtrat und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 200 Mikroliter Dissoziationsreagenz B resuspendieren. Legen Sie das Röhrchen in ein Wasserbad, um die Zellen vollständig in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren. Nach fünf Minuten fügen Sie 200 Mikroliter 5%FBS hinzu, um die Aufschlussreaktion zu beenden, zentrifugieren Sie die Suspension und verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 100 Mikroliter PBS auf Eis resuspendieren.
Mikroskopische Beobachtungen zeigten, dass die Kombination von Dissoziationsreagenz B mit Reagenz A zu einer gründlicheren Dissoziation von Halsschlagadergewebe führte als die alleinige Verwendung von Dissoziationsreagenz A. Insgesamt wurden 176.000 Einzelzellen aus neun linken Halsschlagaden entnommen, wobei die meisten Gefäßgefäße erfolgreich in Einzelzellen mit hoher Lebensfähigkeit dissoziiert wurden. Nach der Verdauung zeigte sich durch unbeaufsichtigtes SIRAH-basiertes Clustering vier Hauptzelltypen in normalen Karotisaterien der Maus.
