Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Natural Science Foundation of China (82070450 an C.T. und 82170466 an L.Z.) und das Stipendium der China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 an F.L.) unterstützt.

Alle unten beschriebenen Tierbehandlungen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Soochow University genehmigt.
1. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien
<ol><li>Verwenden Sie 1x PBS ohne Kalzium und Magnesium und 2,5 U/ml Heparin-Natriumsalz, um die Perfusionslösung herzustellen. Bei 4 °C lagern und bei Gebrauch auf Eis vorkühlen.</li>
	<li>Bereiten Sie das Dissoziationsreagenz A vor, das 125 CDU/ml Kollagenase II und 60 U/ml DNase I enthält, indem Sie 1250 CDU/ml Kollagenase II und 3000 U/ml DNase I mit HBSS verdünnen. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie das Dissoziationsreagenz B vor, das eine Endkonzentration von 0,12 % Trypsin enthält, indem 1 ml 0,25 % EDTA-freies Trypsin (ohne Phenolrot) in 1 ml 1x PBS verdünnt werden. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 10 ml 1,5 % FBS und 10 ml 5 % FBS in 1x PBS vor. Verwenden Sie 1,5 % FBS, um die Halsschlagadern zu poolen, und lassen Sie sie vor der Anwendung auf Eis. Verwenden Sie 5% FBS, um die Verdauung zu neutralisieren, und lagern Sie sie bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Holen Sie sich die Versuchsmaterialien, darunter 1-ml-Spritzen, 20-ml-Spritzen mit 26-G-Nadeln, Sechs-Well-Zellkulturplatten, 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, sterile 40-μm-Zellsiebe und Eisbehälter.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Ausrüstung
<ol><li>Sterilisieren Sie alle chirurgischen Geräte, einschließlich eines stereoskopischen Mikroskops, einer Präparierschere, einer Mikropräparierschere und einer Pinzette mit feiner Spitze.</li>
	<li>Schalten Sie den automatischen Zellzähler ein und halten Sie ihn auf RT.</li>
	<li>Schalten Sie das Wasserbad vorher auf 37 °C ein.</li>
	<li>Die Mikrozentrifuge vor Gebrauch auf 4 °C vorkühlen.</li>
</ol>3. Isolierung der Halsschlagader der Maus
<ol><li>Betäuben Sie die Maus mit 1,25% Tribromethanol durch intraperitoneale Injektion (0,24 ml pro 10 g Körpergewicht) und drehen Sie die Maus um, um zu überprüfen, ob nach 3 Minuten ein Aufrichtungsreflex vorliegt. Euthanasieren Sie dann die Maus durch Zervixluxation und legen Sie sie auf den Rücken. Besprühen Sie die Haut der Maus mit 75%igem Alkohol.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterilisierte Präparierschere, um die Haut zu öffnen und die Brusthöhle freizulegen. Schneiden Sie die Membran auf.</li>
	<li>Schneiden Sie weiter nach oben bis zum Unterkiefer und entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Bindegewebe und Fett, wobei die Halsschlagader freigelegt wird.</li>
	<li>Durchtrennen Sie die untere Hohlvene der Maus, damit das Blut aus dem geschlossenen Kreislauf fließt.</li>
	<li>Injizieren Sie 20 ml vorgekühlte Perfusionslösung mit einer Spritze langsam und kontinuierlich in die linke Herzkammer. HINWEIS: Wenn die Durchblutung erfolgreich ist, werden blutreiche Organe wie Leber, Milz und Nieren grau-weiß.</li>
	<li>Ziehen Sie das gesamte Fett und Bindegewebe um die Halsschlagader herum mit einer Mikropräparierschere unter einem stereoskopischen Mikroskop ab. HINWEIS: Dieser Schritt sollte langsam und vorsichtig durchgeführt werden, um eine Schädigung der Halsschlagader zu vermeiden.</li>
	<li>Isolieren Sie die Halsschlagader von der Maus, waschen Sie sie mit 1x PBS, um das Blut wieder zu spülen, und geben Sie es auf Sechs-Well-Platten mit 1,5 % FBS auf Eis.</li>
</ol>4. Verdau der Halsschlagader zu Einzelzellsuspension
<ol><li>Verwenden Sie eine Mikropräparierschere, um die Halsschlagader in Längsrichtung zu präparieren, und legen Sie sie flach in eine weitere 6-Well-Zellkulturplatte, die 1 ml 1,5 % FBS auf Eis enthält.</li>
	<li>Spülen Sie die Intima vorsichtig mit 1,5% FBS aus, um das Restblut zu entfernen. HINWEIS: Die Spülung sollte sanft und langsam erfolgen, um eine Verletzung der Endothelzellen zu vermeiden.</li>
	<li>Schneiden Sie jede Halsschlagader mit einer Mikropräparierschere in 1,5 % FBS in ca.2 mm 2 Gewebestücke.</li>
	<li>Diese Gewebestücke werden in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 mL-Spitze mit breiter Bohrung überführt, 5 Minuten lang bei 400 x g bei 4 °C zentrifugiert, um das Gewebe auf den Boden zu senken.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Gewebe in 500 μl Dissoziationsreagenz A.</li>
	<li>Legen Sie das Röhrchen für 1 h in ein 37 °C warmes Wasserbad. Pipettieren Sie vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette alle 10 Minuten.</li>
	<li>Geben Sie 500 μl 5% FBS in das Röhrchen und mischen Sie es gut mit einer 1-ml-Pipette.</li>
	<li>Die Zellsuspension wird durch ein 40 μm steriles Zellsieb in ein neues 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen filtriert und bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl Dissoziationsreagenz B.</li>
	<li>In ein 37 °C warmes Wasserbad geben und weitere 5 Minuten verdauen. Während des Aufschlusses alle 2 Minuten vorsichtig pipettieren, um vollständig in eine einzellige Suspension zu dissoziieren.</li>
	<li>Verwenden Sie 200 μl 5%ige FBS, um die Aufschlussreaktion zu beenden, und zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 Minuten bei 4 °C.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl 1x PBS auf Eis.</li>
</ol>5. Untersuchung der Zellsuspension und Einzelzell-RNA-Sequenzierung
<ol><li>10 μl AO/PI-Lösung in 10 μl Einzelzellsuspension geben und vorsichtig mit einer 20-μl-Pipette mischen.</li>
	<li>Pipettieren Sie 20 μl der Mischung in den Kammerschieber und warten Sie 1 Minute.</li>
	<li>Laden Sie den Objektträger in das automatische Zellzählergerät.</li>
	<li>Wählen Sie den AO/PI-Viabilitäts-Assay aus und warten Sie auf den Qualitätsbericht.</li>
	<li>Verwenden Sie ein einzelliges 3-Zoll-Reagenzienkit, um einzellige Gelkügelkügelchen in der Emulsion auf einem Einzelzell-Controller zu erzeugen und die mit Barcode versehene cDNA in einem Thermocycler gemäß dem Protokoll des Herstellers zu amplifizieren. HINWEIS: Hier wurden Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3 verwendet.</li>
	<li>Führen Sie die Sequenzierung auf einem Sequenzer mit einer Paired-End-Lesestrategie von 150 bp (PE150) durch. Verwenden Sie eine Softwareanwendung (Cell Ranger), um unformatierte Basisaufrufdateien mithilfe der mkfastq-Pipeline in fastq-Dateien zu konvertieren. Verwenden Sie dann die Count-Pipeline von Cell Ranger für die Ausrichtung, Filterung, Barcode-Zählung und UMI-Zählung (Unique Molecular Identifier), um Merkmals-Barcode-Matrizen zu generieren13.</li>
	<li>Führen Sie die Reduzierung der Datendimensionalität und Visualisierung mit dem R-Paket Seurat14 durch.<ol><li>Zuerst liest die Read10X()- Funktion von Seurat die Ausgabe der Cell Ranger-Pipeline ein und verwendet dann die Zählmatrix, um ein Seurat-Objekt zu erstellen. Filtern Sie dann die Zellen heraus, die <200 oder >4000 Gene oder ein mitochondriales Genverhältnis von mehr als 10% durch die subset()- Funktion von Seurat betrugen.</li>
		<li>Verwenden Sie NormalizeData() und FindVariableFeatures(), um die Daten zu normalisieren bzw. 2000 hochvariable Features zu identifizieren.</li>
		<li>Führen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) für die skalierten Daten durch, und gruppieren Sie die Zellen mit Dims = 30 und Auflösung = 0,5. Verwenden Sie abschließend die Funktion RunUMAP (), um die Einzelzelldatensätze zu visualisieren, und FindAllMarkers(), um die einzelnen Cluster-Biomarker zu finden.</li>
	</ol></li>
</ol>

Zweistufiger Zellverdau der Halsschlagader der Maus

<ol>
	<li>Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+flow:+roles+of+epigenetic+modulation+in+vascular+endothelium.">Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).</li><li>Libby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications:+A+brief+overview.">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+maps+endothelial+metabolic+plasticity+in+pathological+angiogenesis.">Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).</li><li>Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+gained+from+single-cell+analysis+of+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment.</a> Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).</li><li>Sun, H., Xu, X., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single+epithelial+cells+suspension+from+mouse+mammary+glands.">Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands.</a> Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).</li><li>Korin, B., Chung, J. -. J., Avraham, S., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+of+mouse+glomeruli+for+high-throughput+analysis.">Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).</li><li>Thomson, B., Quaggin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+single+cell+suspension+from+the+murine+iridocorneal+angle.">Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle.</a> Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).</li><li>Leale, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-stage+digestion+of+whole+murine+knee+joints+for+single-cell+RNA+sequencing.">A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).</li><li>Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+aorta.">Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta.</a> Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).</li><li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+UMI-based+single-cell+RNA-seq+preprocessing+workflows.">Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows.</a> Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Depuydt, M. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+of+the+human+atherosclerotic+plaque+by+single-cell+transcriptomics.">Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics.</a> Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).</li><li>Gao, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+of+the+rat+carotid+arteries+uncovers+potential+cellular+targets+of+neointimal+hyperplasia.">Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+the+lumen+of+mouse+carotid+arteries+for+single-cell+multi-omics+experiments.">Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus der Halsschlagader von Wildtyp-Mäusen zur Verfügung, in dem eine zweistufige Verdauungsmethode entwickelt wurde, die den Verdauungsprozess von Kollagenase/DNase und Trypsin integriert. Nach der Qualitätsprüfung der Einzelzellsuspension stellten wir fest, dass sie die Anforderungen für die Einzelzellsequenzierung erfüllte, mit einer Lebensfähigkeit von Zellen von über 85 % und einer hohen Zellkonzentration...

Atherosklerose ist eine chronisch entzündliche Erkrankung, die mit Risikofaktoren wie Bluthochdruck, Hyperlipidämie und Hämodynamik einhergeht1. Die Verzweigungen der Halsschlagader sind anfällig für hämodynamische Veränderungen und führen zur Bildung von Halsschlagadern. Das klinische Erscheinungsbild der Carotis-Atherosklerose kann akut wie Schlaganfall und vorübergehende zerebrale Ischämie oder chronisch wie rezidivierende transiente zerebrale Ischämie und vaskuläre Demenzsein 2. Mechanisch gesehen ist die Halsschlagader das Ergebnis der Interaktion zwischen verschiedenen Gefäßwandzellen und verschiedenen Blutzellen unter pathologischen Bedingungen. Daher ist die Freilegung des einzelligen Atlas der Halsschlagader unter physiologischen und pathologischen Bedingungen besonders wichtig für die Vorbeugung und Behandlung der Entwicklung von Halsschlagadern.
Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ist aufgrund ihrer ultrahohen Auflösung und des Nachweises der Zellheterogenität desselben Zelltyps von Organismen eine der leistungsfähigsten Technologien der biologischen Forschung 3,4. Forscher haben die Einzelzell-RNA-Sequenzierung verwendet, um Forschung in vielen Bereichen durchzuführen, wie z. B. Herz-Kreislauf-Erkrankungen5 und Krebs6. Die schnelle und genaue Trennung von Geweben in einzelne Zellen ist jedoch immer noch eine der größten Herausforderungen. Die enzymatische Dissoziation ist eine häufig verwendete Methode, die hauptsächlich Kollagenase, Papain, Trypsin, DNase und Hyaluronidase umfasst. Insbesondere Kollagenasen sind die wichtigsten Enzymspezies für die Einzelzellverdauung, die hauptsächlich Kollagenkomponenten im Bindegewebe hydrolysiert. Verschiedene Kollagenasetypen sind für die Dissoziation verschiedener Gewebe geeignet, wie z. B. der Brustdrüse7, des Glomerulus8, des Iridokornealwinkels9, des Kniegelenks10, der Aorta 11 und der Lunge12. Aufgrund der einzigartigen physiologischen Eigenschaften verschiedener Gewebe kann die Dissoziation mit der gleichen Methode viele Probleme bei der Erfassung einzelner Zellen verursachen, wie z. B. eine geringe Zelllebensfähigkeit, eine geringe Zellzahl und große Zelltrümmer. Daher ist die Erfindung von Aufschlussmethoden für verschiedene Gewebe für die Herstellung hochwertiger Einzelzellsuspensionen unerlässlich.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine zweistufige Zellverdauungsmethode zu entwickeln, um eine Einzelzellsuspension der Halsschlagader von Wildtyp-Mäusen herzustellen. Entsprechend den Eigenschaften der Halsschlagader kombinierten wir Kollagenase/DNase mit Trypsin, um eine hochwertige Einzelzellsuspension der Halsschlagader der Maus zu erhalten, da Kollagenase Kollagen des Halsschlagaders hydrolysieren kann, das durch Trypsin zu einer Einzelzellsuspension weiter verdaut wurde. Die duale Fluoreszenzzählung von Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI) wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit und Konzentration der Zellen zu bestimmen, und es wurde festgestellt, dass die Einzelzellsuspension die Anforderungen für die Einzelzellsequenzierung erfüllte, mit einer Lebensfähigkeit von Zellen von über 85 % und einer hohen Zellkonzentration. Nach der Verarbeitung von Einzelzelldaten wurden vier Zelltypen, darunter vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs), Fibroblasten, Endothelzellen (ECs) sowie Makrophagen und dendritische Zellen (Mφ/DCs), in normalen Halsschlagadern der Maus nach der Verdauung identifiziert. Die Vorteile dieses Protokolls sind: 1) mehrere Zelltypen in der Halsschlagader identifiziert werden können, 2) die Zelllebensfähigkeit gut erhalten bleibt und 3) es ohne spezielle Ausrüstung leicht wiederholt werden kann. Dieses Protokoll eignet sich für Forscher, die daran interessiert sind, Einzelzell-Multiomics der Halsschlagadern der Maus zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auch bei der Dissoziation anderer Blutgefäße mit entsprechenden Modifikationen hilfreich sein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% EDTA-free trypsin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0205</td>
			<td>Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl saline solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST341</td>
			<td>Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>&#160;SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r009</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211W</td>
			<td>To centrifuge the tissue piece and cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r013</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>css010040</td>
			<td>To filter undigested tissue fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI kit</td>
			<td>Hengrui Biological</td>
			<td>RE010212</td>
			<td>To identify whether the cell is alive or dead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>Mira FL</td>
			<td>To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger software</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>3.0.2</td>
			<td>To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39;Reagent Kits v3</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>1000075</td>
			<td>To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td>Termination of the digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Store at the room temperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>H8060</td>
			<td>Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002560</td>
			<td>Applied for spining down the tissues and cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1000</td>
			<td>Used for cardiac perfusion and resuspension of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat package- R</td>
			<td>Satija Lab</td>
			<td>3.1.2</td>
			<td>To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well cell culture plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>703002</td>
			<td>Place the vascular tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S22</td>
			<td>Keep the digestion temperature at 37 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a single-cell suspension from mouse carotid arteries for single-cell sequencing

Carotis-Arterien sind wichtige Blutgefäße im Hals, die das Gehirn mit Blut und Sauerstoff versorgen, aber eine Carotisstenose tritt auf, wenn die Halsschlagadern durch Plaque verstopft sind. Die Aufdeckung der zellulären Zusammensetzung der Halsschlagader auf Einzelzellebene ist für die Behandlung der Arteriosklerose der Halsschlagader unerlässlich. Es gibt jedoch kein gebrauchsfertiges Protokoll für die Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Halsschlagadern. Um ein geeignetes Protokoll für die Dissoziation normaler Halsschlagadern auf Einzelzellebene mit weniger Zellschädigung zu erhalten, haben wir eine zweistufige Verdauungsmethode entwickelt, indem wir den Verdauungsprozess von Kollagenase/DNase und Trypsin integrieren. Die duale Fluoreszenzzählung von Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI) wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit und Konzentration der Zellen zu bestimmen, und es wurde festgestellt, dass die Einzelzellsuspension die Anforderungen für die Einzelzellsequenzierung erfüllte, mit einer Lebensfähigkeit von Zellen von über 85 % und einer hohen Zellkonzentration. Nach der Einzelzell-Datenverarbeitung wurde in jeder Halsschlagaderzelle ein Median von ~2500 Transkripten pro Zelle detektiert. Bemerkenswert ist, dass eine Vielzahl von Zelltypen der normalen Halsschlagader, einschließlich vaskulärer glatter Muskelzellen (VSMCs), Fibroblasten, Endothelzellen (ECs) sowie Makrophagen und dendritische Zellen (Mφ/DCs), gleichzeitig nachweisbar waren. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um eine einzellige Suspension von Blutgefäßen aus anderen Geweben mit entsprechenden Modifikationen herzustellen.

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease associated with risk factors such as high blood pressure, hyperlipidemia, and hemodynamics1. Carotid artery bifurcations are prone to hemodynamic changes and lead to carotid plaque formation. The clinical presentation of carotid atherosclerosis can be acute such as stroke and transient cerebral ischemia, or chronic such as recurrent transient cerebral ischemia and vascular dementia2. Mechanically, carotid plaque is the outcome of the interaction between different vessel wall cells and various blood cells under pathological conditions. Therefore, revealing the single-cell atlas of carotid vessels under physiological and pathological conditions is particularly important for preventing and treating carotid plaque development.
Single-cell RNA sequencing is one of the most powerful technologies of biological research because of its ultrahigh resolution and detection of cell heterogeneity from the same cell type of organisms3,4. Researchers have used single-cell RNA sequencing to conduct research in many fields, such as cardiovascular disease5 and cancer6. However, quickly and accurately separating tissues into single cells is still one of the main challenges. Enzymatic dissociation is a commonly used method that dominantly includes collagenase, papain, trypsin, DNase, and hyaluronidase. Specifically, collagenases are the major enzyme species for single-cell digestion, mainly hydrolyzing collagen components in connective tissues. Different collagenase types are applicable for the dissociation of different tissues, such as the mammary gland7, glomerulus8, iridocorneal angle9, knee joint10, aorta11, and lung12. Due to the unique physiological properties of different tissues, dissociation using the same method may cause many troubles in acquiring single cells, such as low cell viability, low cell number, and large cell debris. Therefore, the invention of digestion methods for different tissues is essential for preparing high-quality single-cell suspensions.
This protocol aims to develop a two-step cell digestion method to prepare a single-cell suspension of the carotid artery of wild-type mice. According to the characteristics of the carotid artery, we combined collagenase/DNase with trypsin to obtain a high-quality single-cell suspension of the mouse carotid artery because collagenase can hydrolyze collagen of the carotid tissues, which was further digested by trypsin into a single-cell suspension. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, four cell types, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were identified in normal mouse carotid arteries after digestion. The advantages of this protocol are that: 1) multiple cell types in the carotid artery can be identified, 2) cell viability is well preserved, and 3) it can be easily repeated without special equipment. This protocol is suitable for researchers who are interested in studying single-cell multiomics of the mouse carotid arteries. This protocol may also be helpful in the dissociation of other blood vessels with appropriate modifications.

Autor im Rampenlicht: Dissoziation von vaskulärem Gewebe und Erforschung einzelzelliger Subcluster für eine zielgerichtete Therapie 

Herstellung einer Einzelzellsuspension aus den Halsschlagadern der Maus für die Einzelzellsequenzierung

Low solubility and the larger cell debrief are the main difficulties of vascular tissue dissociation. Our two steps or digestion method is very suitable for carotid tissue dissociation and may be used to prepare single cell suspicions for other vessels with minor modifications, making it very helpful in cardiovascular research. This protocol is suitable for obtaining multiple cell types in the carotid artery, and it can be easily repeated without special equipment.In the future, we aim to use cell subclasses discovered by single cell ion sequencing for targeted therapy of cardiovascular disease.

Dieses Protokoll beschreibt eine zweistufige Zellverdauungsmethode zur Herstellung einer Einzelzellsuspension von Maus-Halsschlagadern (Abbildung 1). Diese zweistufige Zellverdauungsmethode kombiniert Kollagenase/DNase mit Trypsin, um die Gefäßwand der Halsschlagader der Maus effektiv zu dissoziieren und hochwertige Einzelzellsuspensionen für die Einzelzellsequenzierung zu erhalten. Nach der Dissoziation wurden die Zellkonzentration und die Zellviabilität mit einem automatisierten Zellz?...

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Hier beschreiben wir ein zweistufiges Zellverdauungsprotokoll zur Herstellung einer Einzelzellsuspension von Maus-Halsschlagadern.

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...

Die geringe Löslichkeit und die Nachbesprechung größerer Zellen sind die Hauptschwierigkeiten bei der Dissoziation von Gefäßgewebe. Unsere zweistufige Verdauungsmethode eignet sich sehr gut für die Dissoziation von Halsschlagader und kann verwendet werden, um Einzelzellverdacht für andere Gefäße mit geringfügigen Modifikationen vorzubereiten, was sie in der kardiovaskulären Forschung sehr hilfreich macht. Dieses Protokoll eignet sich für die Gewinnung mehrerer Zelltypen in der Halsschlagader und kann ohne spezielle Ausrüstung leicht wiederholt werden.In Zukunft wollen wir Zellsubklassen, die durch Einzelzellionensequenzierung entdeckt wurden, für die gezielte Therapie von Herz-Kreislauf-Erkrankungen nutzen.

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Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

2.0K Aufrufe.  Soochow University. Die geringe Löslichkeit und die Nachbesprechung größerer Zellen sind die Hauptschwierigkeiten bei der Dissoziation von Gefäßgewebe. Unsere zweistufige Verdauungsmethode eignet sich sehr gut für die Dissoziation von Halsschlagader und kann verwendet werden, um Einzelzellverdacht für andere Gefäße mit geringfügigen Modifikationen vorzubereiten, was sie in der kardiovaskulären Forschung sehr hilfreich macht. Dieses Protokoll eignet sich für die Gewinnung mehrerer Zelltypen in der Hal...

Serie: Autor im Rampenlicht: Dissoziation von vaskulärem Gewebe und Erforschung einzelzelliger Subcluster für eine zielgerichtete Therapie 

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are clogged by plaque. Revealing the cellular composition of the carotid artery at the single-cell level is essential for treating carotid atherosclerosis. However, there is no ready-to-use protocol for the preparation of single-cell suspensions from carotid arteries. To obtain a suitable protocol for the dissociation of normal carotid arteries at the single-cell level with less damage to cells, we designed a two-step digestion method by integrating the digestion process of collagenase/DNase and trypsin. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, a median of ~2500 transcripts per cell were detected in each carotid artery cell. Notably, a variety of cell types of the normal carotid artery, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were concurrently detectable. This protocol may be applied to prepare a single-cell suspension of blood vessels from other tissues with appropriate modifications.

Here we describe a two-step cell digestion protocol for preparing a single-cell suspension of mouse carotid arteries.